基于PI3K/Akt 信号途径探讨理气消瘿方对结节性甲状腺肿大鼠的作用机制

田曼 祁正亮

鉴于结节性甲状腺肿发病率逐年上升,相关实验及临床研究也日益受到重视,常用治疗方案中理气消瘿方作为常用中药汤剂,临床治疗中已取得一定应用效果,不过其具体药物生效的分子机制尚未被阐明［1,2］。本文拟采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测PI3K/Akt 信号通路中分子蛋白的表达,从细胞内信号转导层面,研究中药理气消瘿方对PI3K/Akt 信号转导途径中相关分子表达的影响和内在规律,从而阐明其治疗结节性甲状腺肿的作用机制,进一步为其临床推广应用提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 大鼠信息 Wist-ar 雄性大白鼠60 只,自湖北疾病控制中心处购得,许可证号为SCXK(鄂)2015-0018,大鼠平均体重为(223.52±10.25)g。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器 北京大龙控股有限公司声场的微量移液器,ABI 公司提供的QuantStudio 6 型实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)仪,北京东胜创新生物科技有限公司提供的EDC-810 型PCR 仪。

1.2.2 处理方法 将60 只大鼠以随机数字法分为空白对照组、消瘿方组、模型组、优甲乐组,每组15 只,实验前置于同一室内环境下饲喂,室温控制在20℃,恒湿50%。

1.2.2.1 造模 大鼠饲喂14 d 后开始造模,除空白对照组外其余3 组小鼠均给予浓度为0.1%的丙基硫氧嘧啶(PTU)溶液,早晨灌胃1 次,持续灌服8 周,利用多普勒超声完成造模检查,确定造模成功后开始后续试验［3］。

1.2.2.2 给药 空白对照组：坚持每日进行普通胃喂养并给予生理盐水灌胃,2 次/d,灌胃2～3 ml/次。模型组：完成造模后同样给予生理盐水灌胃,方案与空白对照组一致。优甲乐组：给予优甲乐(深圳市中联制药有限公司,国药准字H20010522)溶液灌服,浓度0.1 mg/L,1 ml/100 g。消瘿方组：给予活血消瘿方(湖北省中医院药剂科,批号：鄂药科试剂Z20090005)灌服,组方为：柴胡、青皮、橘叶、郁金、蜣螂虫、细辛、三棱、白芥子、莱菔子、瓜蒌皮,每片含生药0.45 g,将药碾末后倾入离心管,加Milli-Q 纯水振荡混匀配制成15%混悬液,灌服给予浓度为88 g/L 的理气消瘿方溶液,灌服,1 次/d,持续灌服8 周。

1.2.3 标本获取 完成最后1 次干预后禁食12 h、禁饮2 h,给予常规麻醉后固定于鼠台,切开大鼠颈部皮肤,暴露气管后找到两侧甲状腺,分离周围组织后取部分甲状腺组织,保存在2 ml 冻藏管内,并放入冰箱备用,温度为-20℃。

1.2.4 RT-PCR 检测 ①PI3K 引物顺序为：5'-GC TCTTCTTCCACCTGTCTCG-3'/5'-CACAGCCCGAAGT CCGTTA-3',扩增产物大小为176 bp,Akt 引物顺序为：5'-TGAGACCGACACCAGGTATTTTG-3'/5'-GCTGAG TAGGAGAACTGGGGAA-3',扩增产物大小为135 bp［4］。Tunel 试剂盒及配套试剂(Roche,货号11681817910),DAB显色剂(DAKO,货号K5007)。②RNA 获取：13000 r/min完成离心,离心时间10 min,后续加入250 μl 氯仿,震荡离心管15 s 后孵育3 min,再以相同转速离心8 min,转移上清液至新离心管内,加入0.8 倍体积异丙醇,孵育15 min,再度离心10 min,获得RNA。③反转录：取PCR 管,加入总RNA 2 μg,加入去离子水10 μl,并置入dT 18 μl,混合均匀后完成离心,冷却后加入反应试剂,在42℃条件下孵育60 min,给予80℃加热,持续5 min 终止反应。取0.5 ml PCR 管,逐次加入试剂并完成PCR 扩充,使用△△CT 法完成结果处理。

1.3 观察指标 比较四组大鼠 PI3K、Akt 信号通路分子表达量以及1 个月内存活情况。

1.4 统计学方法 采用SPSS23.0 统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组PI3K 信号通路分子表达量比较 空白对照组PI3K 信号通路分子表达量为(1.00±0.01)低于模型组的(1.52±0.07)、优甲乐组的(1.41±0.07)、消瘿方组的(1.31±0.08),差异均具有统计学意义(t=28.482、22.457、14.892,P＜0.05)。消瘿方组PI3K 信号通路分子表达量明显低于模型组及优甲乐组,差异均有统计学意义(t=7.651、3.643,P＜0.05)。

2.2 四组Akt 信号通路分子表达量比较 空白对照组Akt 信号通路分子表达量为(1.00±0.01)低于模型组的(2.14±0.08)、优甲乐组的(2.01±0.03)、消瘿方组的(1.67±0.07),差异均具有统计学意义(t=54.764、123.70、36.697,P＜0.05)。消瘿方组Akt 信号通路分子表达量均低于模型组、优甲乐组,差异均具有统计学意义(t=17.124、12.388,P＜0.05)。

2.3 四组大鼠存活情况比较 空白对照组存活15 只,存活率为100.00%；模型组存活5 只,存活率为33.33%；优甲乐组存活8 只,存活率为53.33%；消瘿方组存活15 只,存活率为100.00%。空白对照组小鼠存活率100.00%明显高于模型组的33.33%、优甲乐组的53.33%,差异均具有统计学意义(P＜0.05)；空白对照组与消瘿方组大鼠存活率比较,差异无统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

甲状腺肿属于常见甲状腺疾病。触诊和高分辨率超声检查发现的人群甲状腺结节患病率分别为3%～7%和20%～76%［5］。甲状腺单发结节患病率为11.6%,甲状腺多发结节发病率为7%,近年来,此病的发病率呈逐年上升趋势,而临床上也越来越多见其与甲状腺癌并存的报道。

当前本病的研究分析认为细胞异常凋亡/增生在甲状腺肿发生中起到了重要作用。在部分学者的研究中发现,甲状腺肿合并有增生结节的患者其P27 表达量明显高于甲状腺癌及单纯甲状腺肿患者,提示患者病灶处于细胞增殖阶段,因而猜测结节性甲状腺肿存在一定恶变转化能力。而在人TNF 相关凋亡诱导配体(TRALL)检测中有学者发现,甲状腺癌与结节性甲状腺肿患者TRALL 阳性表达率较正常人冥想更高,推测细胞的增生与凋亡关系失衡为也可能为本病发展的重要因素。

在分子调控机制的研究中指出,PI3K/Akt 信号通路可对机体细胞的增殖、凋亡进行调控,其中Akt 能够有效利用磷酸化丝氨酸等对细胞的存活及增殖产生影响,其主要利用激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及其相应下游途径完成特殊蛋白翻译,促成细胞增殖。该分子通路可激活P70S6K,完成核糖体蛋白mRNA 翻译,另外也可通过促进4E-BP-1 进一步完成磷酸化,达到增加mRNA 转录的效果,继而对蛋白质合成产生调控作用。PI3K/Akt 信号通路均可抑制4E-BP-1 表达,达到调控细胞增殖的效果,此外还可对P21、P27 的表达进行抑制,对G1期进程起到加速作用,促使细胞分化。在细胞凋亡过程中,PI3K/Akt 信号通路可通过抑制Forkhead 家族转录因子活性对BAD的多种物质进行磷酸化,阻断P53,调节NF-κB,上调凋亡抑制因子(IAPs)表达等充分对细胞凋亡产生抑制。就本次研究结果显示,空白对照组PI3K 信号通路分子表达量低于模型组、优甲乐组、消瘿方组,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。空白对照组Akt 信号通路分子表达量低于模型组、优甲乐组、消瘿方组,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。表明在结节性甲状腺肿的发生与PI3K/Akt 信号通路表达上调有直接关联。

临床结节性甲状腺肿治疗中常用优甲乐为常用药物,其主要通过增加机体蛋白酶的合成及酶活性影响患者细胞增殖发育达到治疗目的,但临床应用中存在一定局限性。结节性甲状腺在中医学上归属于“结瘿”范畴,结节性甲状腺肿以正气亏虚为发病内因,诱因为情志失调,高发原因为饮食起居失常,在整个发病过程中痰瘀贯穿其中,作为一个病理环节极为重要,也极易导致该病反复复发和迁延难愈,结节性甲状腺肿痰血瘀阻不但具备痰瘀的特点,而且呈现自身特点,以甲状腺结节、甲状腺局部疼痛、甲状腺肿大等为主要临床表现。消瘿方由柴胡、青皮、橘叶、郁金、蜣螂虫等多种中药材组合而成,主要用于活血化瘀,组方内郁金可活血止痛、行气解郁；柴胡疏肝破气,消积化滞；橘皮理气健脾、燥湿化痰；细辛祛风止痛；三棱破血行气、降气化痰；莱菔子消积止痛、消食除胀；蜣螂虫活血止痛；瓜蒌皮清化热痰,利气宽胸；柴胡具有升举阳气之效,多药合用于本病治疗中效果明显,已为临床验证。经本次大鼠实验发现,消瘿方组PI3K/Akt信号通路分子表达量均明显低于模型组及优甲乐组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。空白对照组小鼠存活率100.00%明显高于模型组的33.33%、优甲乐组的53.33%,差异均具有统计学意义(P＜0.05)；空白对照组与消瘿方组大鼠存活率比较,差异无统计学意义(P＜0.05)。猜测本方可抑制PI3K/Akt 信号通路激活达到调控患者细胞凋亡/增殖的目的,继而对本病起到一定治疗效果。

在胡根等［5］的研究中同样进行分组研究,发现模型鼠的PI3K/Akt 信号通路分子表达量较空白对照组明显更高,而应用消瘿方治疗的大鼠PI3K/Akt 信号通路分子表达量较常规西药治疗及模型鼠明显更低。本次研究与其研究存在一定相似性。

综上所述,消瘿方用于结节性甲状腺肿治疗中可通过抑制PI3K/Akt 信号通路的激活,达到治疗目的。