不确定度来源分析理念在ELISA检测质量控制中的应用

赵国有 林滢 于维森

(青岛市疾病预防控制中心 山东青岛266033)

1 前言

酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assays，ELISA)具有敏感度高、特异性强、自动化程度高、适合大批量标本检测等诸多优点，目前在很多领域都得到广泛应用。但该方法操作步骤较多，对试验结果的影响因素较多，对实验人员、仪器设备、试剂等有较高要求，操作步骤若不规范会对试验结果产生极大影响[1]。本文利用不确定度来源分析的理念[2-3]，对ELISA测定中的不确定度来源进行归纳与分析，确定影响ELISA试验结果的主要因素，并采取合适的措施和规范的操作，将其对结果的影响控制在可接受的水平。

2 确定ELISA试验检测结果不确定度来源

ELISA检测过程中，主要的环节包括样品制备、试剂的选择、加样、温育、计时、洗板、酶标仪测量、结果计算等。

按照测量不确定度来源分析的理念，针对ELISA检测的操作环节，对ELISA测定中不确定度的来源进行分析。

2.1 A类不确定度因素

A类不确定度影响因素包括(但可能不限于)对被稀释后的被检血清或抗原的每个浓度进行的多个平行进检测引起的不确定度、不同人员之间不同检测同一样品引起的测量不确定度、标准样品引起的不确定度、不同品牌试剂用于同一血清进行引起的不确定度、被检样品/试剂盒存放条件引起的不确定度、采样是否正确及样品是否被污染引起的不确定度、样品运输和储存条件引起的不确定度、处理样品引起的不确定度、环境条件引起的不确定度、设备因素引起的不确定度、未知的随机因素引起的不确定度。

2.2 B类不确定度影响因素

B类不确定度因素因素包括(但可能不限于)酶标仪的分辨力、孵育所用的恒温箱温度、加样器、天平、未知随机因素(如设备供电是否稳定、环境温度是否变化很大、试剂反复冷藏、人员身体状况等等)。

3 不确定度来源分析及相应控制措施

通过分析ELISA测定中不确定度的来源，根据检测的方法原理发现，影响ELISA结果不确定度的因素分布在ELISA试验的各个环节，主要有标本、试剂、仪器设备、实验操作因素及实验环境等方面。通过对这些因素的良好控制，可尽可能缩小由这些因素带来的检测结果的不确定性。

3.1 标本

合格的标本是保证检测结果准确的前提，标本中的内源性和外源性因素都可能干扰检测。对可能含有类风湿因子、高浓度非特异性免疫球蛋白等内源性干扰因素的标本建议按照试剂盒说明书的要求对标本进行相应处理，如对标本应用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，在56℃下进行灭活(30 min)[4]。

在标本接收时应对标本进行验收，排除不合格的标本。以血清标本为例，血液标本采集、保存和运送等环节操作不当所造成的标本溶血、污染、长时间贮存、加入抗凝物质等都可能产生一些外源性物质，对检测结果产生影响。因而血液采集后不可剧烈震荡，避免溶血，因血红蛋白具有类过氧化物活性，可催化底物显色；同时样本收集过程中尽量防止细菌污染，避免细菌可能分泌酶及内源性H R P等对检测结果的影响；标本采集后，应在血液充分凝固后再分离血清，避免纤维蛋白原非特异性吸附对检测结果产生影响；标本尽量及时检测，不能及时检测的应冷冻保存，并且不要反复冻融，避免破坏蛋白分子结构。加入抗凝物质到标本中时，尽可能不使用酶抑制剂，避免ELISA中的酶活性降低[5]。

3.2 试剂

试剂是影响检测结果的一个重要因素，试剂的质量直接决定了检测的质量。因此实验室必须通过严格的评估，根据检测目的选择和订购质量稳定、可靠的试剂，并保证保存条件。试剂在使用过程中的不规范也会导致试验结果不准确，造成结果偏差。如使用过期试剂，不同厂家或不同批号试剂盒组分混用；试剂质量不合格等[6]。因此，在试剂盒使用的过程中，应严格遵照试剂盒说明书的要求操作。在实验之前要从冰箱将试剂盒拿出平衡到室温，避免对抗原抗体结合和反应速度造成影响[7]。严格按照试剂盒要求设立内部对照，不能随意减少，同时最好也设外部对照，通过内部对照和外部对照判定试验的有效性，如果无效，需分析原因，重新试验。

3.3 仪器设备

ELISA测定中使用的主要仪器设备包括微量加液器、酶标洗板机、恒温箱或水浴箱、酶标仪等。应选择质量好、精度高的微量加液器，定期对加液器进行检定或校准；使用水浴箱时应注意温度调控精度，保持水位和水质清洁；应选择分液精度高、均一性好，残液量小的洗板机，尤其要注意洗板机的日常维护，以防止管道堵塞和腐蚀，洗板时应注意观察，避免洗板机管道或洗板针阻塞等引起的洗板不够彻底而对检测结果的影响；酶标仪是测读ELISA结果吸光度的重要设备，每年应进行检定或校准，使用前先预热仪器15～30 min，设备运行稳定后再进行检测，检测时应按照试剂盒的要求选择合适的波长，平时注意酶标仪的日常维护，防止滤光片霉斑等对检测的影响。

3.4 实验操作因素

3.4.1 加样

加样是ELISA检测的重要步骤，其精度会直接影响检测结果，除选择高质量合适量程的微量移液器外，正确使用移液器也是非常重要的。加样前应首先检查移液器，如发现体积不足，应更换合格的移液器。使用时应选用合适的高质量枪头并安装严密，避免吸入、打出的体积不准确。在加样时吸头应避免碰触包被的抗原，加试剂前，应先将试剂瓶翻转数次使液体混匀。吸取不同试剂、不同标品时应更换枪头，避免交叉污染。加样时试验人员应当精神集中，尤其标本较多时，避免漏加、误加等低端错误，最好加样前先编制加样蓝图，对照加样图小心加入。加样过程中的错加、漏加试剂，或加量不足、顺序颠倒，或加样时间过长，加样后未混匀等都会对检测有很大影响。

3.4.2 孵育

在ELISA法检测中，孵育对检测结果有重要影响。我国目前大部分ELISA试剂盒检测为两步法，需要两次孵育。在孵育过程中，需要控制2个指标：孵育温度、孵育时间。在孵育时要严格执行说明书的要求，不可随意更改温度和时间。常用孵育方式有温箱法、水浴法等，为避免恒温箱或水浴箱面板显示的温度与实际不符，应在箱内使用校准后的温度计，并以箱内温度计为准。温箱法孵育过程需要经过一定时间方可达到平衡点[8]，而且可能存在酶标板受热不均衡所致的周围孔与中央孔结果的吸光度差异(即边缘效应)。水浴法能较好解决因受热不均衡的问题。因此孵育通常采用的是水育法，孵育时应注意板条不能叠加放置，应按要求贴封片或加盖，避免样品或稀释液蒸发。应严格按照说明书要求控制时间，不要随意延长或缩短。这些情况会出现显色弱(高)、灵敏度低(高)、重复性差等。

3.4.3 洗板

采用ELISA法检测过程中，要进行多次洗板。通过洗板，除去未被结合的抗原、抗体或结合物，是十分关键的环节。洗板是否彻底对检测结果有直接影响。在该步骤中，洗涤液的配制应严格按照试剂盒说明书的要求进行，不可随意更改稀释倍数，同时稀释用水应符合要求；应选择加液精度高、分配均一性好、残液量小的酶标洗板机，按照试剂盒说明书的要求设置洗涤次数、浸泡时间；应根据酶标板的规格对吸液头高度进行调整。洗板时要注意洗液不要溢出孔外，随时观察洗板情况以及时发现洗板针堵塞而引起的洗板故障。不要人为增加或减少洗板次数及浸泡时间，否则会出现假阳性、白板、重复性差等问题[9]。

3.4.4 读板

读板是ELISA操作的最后一步，显色反应终止后立即使用酶标仪比色，终止后一段时间后再比色对最后结果会有较大影响。测定前先用棉签把酶标板底部的水珠擦干净，检查各孔是否有气泡，否则测定值会变高，有可能产生假阳性结果。酶标板转移到酶标仪的过程中一定要动作轻柔，避免酶标孔中液体溅出。应严格说明书要求设定比色波长、阴阳性对照、计算公式等参数。任何参数设置的错误都会导致结果的错误，需要格外注意。

3.5 实验室环境因素

实验室环境因素尤其是环境温度对ELISA试验多个过程都有影响，最主要的是对加液量有较大影响。因此根据试验要求选择合适的实验室温度并保持恒定可减少由于实验室温度带来的多种不确定性。

4 结论

综上所诉，利用不确定度来源分析的理念，确定影响ELISA试验结果的因素及对每个影响环节进行规范控制，将对保证ELISA检测结果的准确可信具有重要意义。