乳腺癌前哨淋巴结转移术中检测进展：一步法核酸扩增技术

张璐，白俊文

（1.内蒙古医科大学附属医院甲乳外科，内蒙古呼和浩特010050；2.内蒙古医科大学，内蒙古呼和浩特010050）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，2020年全球最新癌症数据表明，乳腺癌取代肺癌，成为全球第一大癌，随着乳腺癌发病率及病死率的增加，乳腺癌的治疗越趋重要[1-2]。腋窝淋巴结（axillary lymph node，ALN）转移情况已成为乳腺癌患者整体生存最重要的预后指标，因此腋窝淋巴结清扫术（axillary lymph node dissection，ALND）是早期乳腺癌手术治疗的一部分，亦是造成上肢淋巴水肿等乳腺癌术后并发症的主要原因[3]。20世纪90年代发现的一种微创、能高度准确检测ALN 转移的方法，即前哨淋巴结活检（sentinel lymph node biopsy，SLNB），历经数十年发展，SLNB 已成为早期乳腺癌患者的标准治疗方法[4-5]。一系列大样本前瞻性临床试验证实了SLNB 的安全性，SLNB 可以提供准确的ALN 分期，前哨淋巴结（sentinel lymph node，SLN）阴性及低负荷SLN 阳性患者SLNB 替代ALND 的腋窝复发率和并发症发生率很低，为其提供了循证医学的证据[6-13]。准确、快速的SLN 术中诊断变得尤为重要，冷冻切片（frozen section，FS）和印片细胞学（touch imprint cytology，TIC）是术中病理检查的常用方法，FS 特异度几乎100%，敏感度也较细胞学高，但假阴性率约为10%～20%；TIC特异度高但敏感度低，所以两者的准确性都受到限制，敏感度在57%到74%之间[14-15]。FS 和TIC 没有统一的诊断标准，因此，临床上迫切需要一种结果准确、操作简便的新型检测方法。一步法核酸扩增（one-step nucleic acid amplification，OSNA）是一种通过细胞角蛋白（cytokeratin 19，CK19）检测SLN 转移的方法，既简便又快速，适合于SLN 转移的术中检测[16]。

1 乳腺癌SLN检测的临床意义及现状

乳腺癌目前治疗方式仍以手术治疗为主。随着乳腺外科保守理念的流行，不仅乳房能保留，腋窝也可以有条件的保留[17]。SLNB 无疑是乳腺外科领域的一个跳跃式的进展。将SLN 定义为从原发肿瘤向区域淋巴结引流的第一站淋巴结，它可以为1 个或1 组，是乳腺肿瘤淋巴结转移首先经过的解剖位置。以SLN 的状态评价整个区域淋巴结的状态，即以SLNB 病理结果评价区域淋巴结有无受侵，其重要性及有效性毋庸置疑，目前腋窝SLNB 已成为乳腺癌患者手术治疗的标准处理模式[18-22]。当检出SLN 阴性可避免ALND，同时也可避免术后上肢淋巴水肿等乳腺癌术后并发症；检出SLN 阳性患者可一次完成ALND，可以避免患者二次手术费用的负担和手术风险，减少住院时间。SLNB 与示踪剂的关系密不可分，临床中常用的是亚甲蓝注射液联合核素示踪剂（99mTc 标记的硫胶体），可使检出率增加的同时降低假阴性率[23]。在临床工作中，SLN 是否转移通过FS 的组织病理学或TIC 检测，并通过术后常规的病理学检测来确认SLN 是否有转移。

1.1 SLN转移灶类型判定标准

SLN 的准确诊断对于腋窝的准确分期、确定术后治疗方案及降低术后腋窝并发症等至关重要。根据AJCC 乳腺癌TNM 分期第8 版，SLN 转移分为宏转移、微转移和孤立肿瘤细胞（isolated tumor cell，ITC）。宏转移：病理学检测的阳性淋巴结存在1 个以上＞2 mm 的肿瘤病灶，其他阳性淋巴结至少存在微转移。微转移：肿瘤病灶最大径＞0.2～2 mm，或单张组织切片不连续，抑或接近连续的细胞簇＜200 个细胞。ITC：单个细胞或最大径≤0.2 mm的小细胞簇，单张组织切片不连续或接近连续的细胞簇≤200 个细胞簇。

1.2 FS快速病理检查

目前FS 在SLN 是否转移中的诊断应用非常广泛，Godazande 等[24]报道的FS 的准确率为78.4%，假阴性率为20.9%，并认为在评估低肿瘤负荷（＜2 mm的微转移灶）的淋巴结时敏感度较低。2011年一项包括13 062 例患者的Meta 分析[25]显示，FS 对任何SLN 转移灶的总体敏感度为73.0%，其中宏转移的敏感度为94.0%，微转移和ITC 的敏感度为40%。Lanitis 等[26]研究表明，FS 的准确率为96.1%，假阴性率为11.7% （ITC：6.8%，微转移：7.7%，宏转移：4.0%）这也说明FS 在SLN 宏转移检出率更高。Shojaee 等[27]结果认为，FS 的敏感度，特异度和诊断准确性分别为24%、90%和43%，在FS 中，SLN阳性和阴性分别为15.7%和84.3%，而在最终病理中，SLN 阳性和阴性分别为41.0%和58.8%。这一差异源于FS 的假阴性率，为31.3%。总而言之，FS 有较高的准确率和较低的假阴性率，但其缺点是切片较厚，染色欠佳，与常规石蜡病理不能完全符合，而且易耗损组织。

1.3 TIC病理检查

TIC 是检测SLN 转移的一种简单且经济高效的技术。Uno 等[28]对367 例患者507 枚淋巴结进行分析，结果表明，TIC 诊断SLN 转移的敏感度为84.1%，特异度为100.0%，准确率为97.4%；TIC 可检测出全部的宏转移，而只检出约50.0%的微转移，未检测出ITC。一项回顾性研究[29]对1 227 例乳腺癌患者评估TIC 检测SLN 的敏感度，结果表明，TIC 的敏感度为68.6%，特异度为99.8%。Hashmi 等[30]比较114 例患者TIC 和FS 检测SLN 转移的准确性，结果表明，TIC 的敏感度，特异度和诊断准确率分别为83.7%、98.5%和92.1%，而FS 的敏感度，特异度和诊断准确性分别为93.9%、100%和97.4%；检测微转移时TIC 和FS 的敏感度分别为14.3% 和57.1%， 诊断准确率分别为90.3% 和95.8%；检测宏转移时TIC 的敏感度和特异度分别为95.2% 和98.5%，而FS 的敏感度和特异度为100%。尽管FS 的总体敏感度高于TIC，但TIC 检测宏转移的敏感度与FS 相当。综上，TIC 具有不耗损标本、操作简便、廉价等优点，而且通过增加取样面积和多层面印片提高诊断的准确率。

1.4 术后常规病理检查

中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范（2019年版）[31]推荐SLN 术后常规病理检查的金标准是逐层切片行病理检测。推荐将SLN 沿长轴切成2 mm 厚的组织块，对每个组织块进行逐层或连续切片病理检测，3 层切片间距为0.2～0.5 mm。而常规病理检测技术中也存在着一些缺点，其不能对大量的SLN 进行分析、细胞学的敏感度在33.0%～73.0%，在微转移和浸润性小叶癌中常常出现假阴性结果，而且病理组织学分析是一种昂贵的分析SLN 方法，还需要病理学家分析标本以得出最终的结论[32]。

2 OSNA检测乳腺癌前哨淋巴结转移

在当今的精准医疗时代，应准确评估SLN 是否转移。常规的FS 和TIC 对SLN 诊断具有较高的敏感度和特异度，但其存在主观性、非标准化、检测的组织量少等缺点，需要寻求更为准确的术中快速分子诊断技术。OSNA 是一种仅需一步操作即可以匀浆标本做为模板，对靶向核酸基因扩增并检测的技术。采用OSNA 技术，可以对淋巴结中的目标基因进行高精度、快速、简便的检测。

2.1 OSNA的原理

OSNA 在选择目的基因的标记物时，先从人类遗传基因数据库中选择了45 个在乳腺/乳腺癌组织中高表达，而在正常淋巴结组织中低表达的遗传基因，然后使用定量逆转录多聚酶链技术的方法，筛选出在转移阳性的淋巴结组织中高表达，而在转移阴性的淋巴结组织中低表达的7 个候选遗传基因。进一步研究发现，这7 个候选遗传基因在转移阳性和转移阴性的淋巴结组织中表达量存在很大的差异。最终将在转移阳性淋巴结组织中表达量最高的CK19mRNA 选为最适合于乳腺癌淋巴结转移检测的遗传基因标志物，CK19 标记物在95%以上的乳腺癌中均有表达，避免了基因组DNA 扩增（或CK19 基因假扩增）[33-34]。CK19 在乳腺上皮细胞表达，而在淋巴结中不表达，当检测到SLN 中CK19 mRNA 扩增时，高度怀疑该淋巴结有乳腺癌转移[35]。近年来发展的定量逆转录多聚酶链技术检测一般需要数小时，包括mRNA 的提取、纯化和cDNA 合成等多个步骤，不适于术中检测SLN[35]。为了减少术中检查所需的时间，OSNA 依据反转录-环状介导等温DNA 扩增方法，在mRNA 不纯化的情况下进行基因扩增，通过在恒定温度下用引物和DNA 聚合酶II 的混合物对样本完成检测[36]。OSNA可同时检测4 个完整的SLN，仅需30～40 min[16]。

2.2 OSNA的结果分析

从每个SLN的中心取出1个非常薄的切片（1 mm）进行病理检查后，剩余的淋巴结切片在4 mL 的Lynorhag 裂解缓冲液（Sysmex，Kobe，Japan）pH 为3.5 中均化，并在室温下进行短暂离心，然后使用RT-LAMP 对RD-100i 系统中的2 μL 上清液进行分析。结果分为阴性（＜2.5×102拷贝/μL）、（+）即微转移（＞2.5×102拷贝/μL，＜5.0×103拷贝/μL）、（++）即宏转移（＞5.0×103拷贝/μL）和+i（常规样品抑制，稀释样品≥2.5×102拷贝/μL）。分类为+i 的患者也被认为是阳性[37]。

2.3 OSNA在临床中的应用

OSNA 从2007年开始应用于临床，无论在术中还是术后都是一种准确的检测SLN 转移的方法[38]。这种新兴技术具有半定量、可重复性、准确性和分析整个SLN 的优点，被越来越多的中心所采用[39]。Szychta 等[40]分析了105 个SLN，中心1 mm 的SLN 切片用于FS 检查，用OSNA 分析SLN 的2 个层面，结果表明，与FS 相比，OSNA 更容易检出SLN转移（P＜0.000 1）；不一致的结果有8 个SLN，OSNA 检测为阳性（2 个检测结果为ITC，6 个检测结果为微转移）而FS 检测为阴性；OSNA 的敏感度为100%，特异度为90.47%。Hintzen等[41]分析了271例患者459 个SLN，对比常规组织学检查和OSNA 检查结果，表明两组之间的宏转移相似，差异无统计学意义（组织学检出率为17.9%，OSNA 检出率为16.2%，P=0.715）；在微转移方面，OSNA 优于常规组织学检测（组织学检出率为11.4%，OSNA 为25.0%，P=0.004）；在分析乳腺癌中SLN 是否转移，OSNA 是一项高度敏感的技术，在微转移方面更胜一筹。Santaballa 等[37]研究也表明，OSNA 较病理学更易检出SLN 微转移（P=0.000 7）。在常规病理学检测为ITC 时，据报道，OSNA 对小体积转移灶的检测更敏感，OSNA 检测有时会受到抑制，这会导致假阴性结果（＜250 拷贝/μL），如在稀释样品中（＞250 拷贝/μL）就为阳性[42]。有研究者[43]认为当结果为（100～250 拷贝/μL）相当于ITC，还有待进一步研究确定。国内王永胜等[9]入组了全国5 个乳腺病中心552 例原发性乳腺癌患者，共探及SLN 1 188 枚，OSNA 的准确度、敏感度、特异度分别为91.4%、83.7%和92.9%，对于SLN微转移，OSNA的敏感度优于FS（P=0.289），显著优于TIC（P=0.007）。

OSNA 技术还具有预测非前哨淋巴结（nonsentinel lymph node，nSLN） 转移的风险。Cuffolo等[44-45]报道总肿瘤负荷（total tumor load，TTL）似乎对nSLN 转移有预测价值。TTL 定义为所有阳性SLN 中CK19 mRNA 的总数。利用TTL 可以确定一个阈值，在该阈值下可以避免不必要的ALND。Peg等[46]试图利用TTL 作为早期乳腺癌的预后指标，对950 例患者进行研究发现，TTL 与无病生存（P=0.000 004）、局部无复发生存（P=0.001 4）和总生存（P=0.003 2）相关；表明TTL 是早期乳腺癌患者评估ALN 转移的一个潜在预后分期工具；对于SLN阳性手术后未进行ALND 的患者，这一分组方法（低危复发风险TTL＜2.5×104拷贝/μL，高危复发风险TTL＞2.5×104拷贝/μL）可能会对后续治疗策略有所帮助；这项新的数据证实了TTL 在腋窝转移低负荷患者中的临床价值，可以部分地取代没有进行ALND 患者的腋窝分期信息。TTL 作为一种预测工具，在应用于临床之前，显然还需要进一步的验证研究。为避免ALND 的并发症，OSNA 预测nSLN 转移的潜力将继续受到关注。同时，OSNA 在新辅助治疗方面也具有一定的意义。新辅助治疗（neoadjuvant treatment，NAC）后淋巴结常常发生纤维化或萎缩，导致取材时难以识别。Peña 等[47-48]研究表明在NAC 后患者的SLN 转移检测能力方面，OSNA 是一种敏感度高、特异度高和可重复的诊断技术。Vieites 等[49]对314 例患者行NAC 后进行术中SLN 活检，结果表明，TTL 可以预测nSLN 的转移（曲线下面积=0.87），截止值为1.5×104拷贝/μL时，阴性预测值为90.5%；经过5年的随访，≤2.5×104拷贝/μL 患者的DFS＞2.5×104拷贝/μL 患者（P=0.001 7）。Espinosa-Bravo 等[50]研究表明，针对在NAC 治疗后的SLN 阳性患者，OSNA 对SLN 的精确评估可降低18.5%二次ALND 手术。

3 结 论

随着早期乳腺癌检出的增多，ALN 阴性患者已占据一半以上，如对所有患者进行ALND，将只有一小部分患者受益，大部分患者接受了过度治疗。SLN 为腋窝分期的金标准，精准检出SLN 是否有转移是外科医生所追求的。OSNA 是第一个对转移淋巴结中靶基因mRNA 进行半定量检测的方法，初步试验取得令人满意的效果。在操作时更标准化，检测敏感度更高，术中快速定量可区分宏转移和微转移，指导手术方案，运用术中SLN 定量结果制定预后模型进行深入的临床分析，操作简单，可重复性更高，可更精准的明确SLN 的转移数目，同时可为乳腺癌的腋窝分期提供准确而及时的信息，避免患者进行二次手术，以便临床医生制订后续的手术方案及治疗措施。该技术有望成为一种新的手段，服务于乳腺癌患者，在中国推广使用。