长链非编码RNA的中医药治疗骨质疏松症研究进展

林若慧 李生强 陈娟 谢丽华 葛继荣

1.福建中医药大学，福建 福州 350122 2.福建省中医药科学院基础研究所骨质疏松证候基因组学研究室，福建 福州 350003

骨质疏松症是一种以骨量丢失，骨组织微小结构破坏，引起骨强度下降和骨脆性增加为特征的全身代谢性疾病，临床上多见于绝经后妇女。中医认为骨质疏松症属于“骨痿”等范畴，祖国医学辨证治疗及预防骨质疏松症具有明显的优势甚至效果显著，但中医理论指导下中医药治疗骨质疏松症的分子机制仍不明确。骨质疏松症分子生物学的研究发展为OP的中医药治疗研究开辟新的思路，这对临床上中医药的广泛应用具有重要指导意义。长链非编码RNA是近年来的研究热点，是控制多种基因表达以及参与多种生物学过程的重要表观遗传调控因子。越来越多的研究表明，lncRNAs在骨质疏松症、骨关节炎等疾病的部分中医证型中差异性表达[1]，中药调控lncRNA干预治疗骨骼疾病也逐步成为医学领域的热点。因此，本文基于lncRNA总结近年来中医药治疗骨质疏松症的研究进展，进一步表明lncRNA在骨质疏松症中医药治疗的分子机制中的研究价值，为临床实践提供坚实的理论基础。

1 lncRNA简介

lncRNA即长链非编码RNA，是长度大于200个核苷酸、不被翻译成蛋白质的一类功能性RNA分子，最早被发现具有诱导蛋白结合影响靶点活性，影响mRNA转录或构成细胞结构成分等功能[2]。研究表明，某些lncRNAs参与了人类疾病的发病机制，如骨代谢疾病、癌症、心血管疾病等[3]；并且与细胞周期、干细胞分化等生物进程相关[4-5]。同时，越来越多证据表示lncRNA 在基因调控上的重要作用，分别为表观遗传调控、转录及转录后水平影响基因表达[6-7]。

2 骨吸收-骨形成过程中lncRNA的表达

骨骼的完整性由不断重复的动态“骨重建”维持[8]，而骨重建由成骨细胞(osteoblasts，OB)、破骨细胞(osteoclast，OC)和骨细胞等组成的骨骼基本多细胞单位实施。随着年龄增加，骨吸收则大于骨形成，引起骨代谢失衡导致骨质疏松。lncRNA参与了骨质疏松症骨代谢失衡的动态过程，主要涉及成骨细胞、破骨细胞分化和调控，并在骨代谢相关信号通路中有重要的调节作用。

研究表示lncRNA-H19、lncRNA-HIF1α-AS1[9]、lncRNATUG1[10]、lncRNAMEG3[11]、lncRNAMALAT1[12]等可能参与了成骨细胞的增殖过程。其中lncRNA-H19[13]则是通过靶向miR-675间接诱导成骨细胞增殖，同时充当竞争性内源RNA[14]激活Wnt信号传导促进成骨细胞分化；此外，lncRNA-H19、lncRNAMEG3和lncRNATSIX[15]通过miRNA间接减弱成骨细胞的增殖。RUNX2转录因子是促成骨分化通路中的关键因子，有研究表明lncRNA ANCR[16]与EZH2特异性结合能促进Runx2表达从而促成骨分化。

在破骨细胞功能和骨吸收过程中，lncRNA调控的信息较少。洪宇桁等[17]认为lncNEAT1促进破骨细胞分化并抑制成骨细胞分化；另有Dou等[18]对破骨细胞形成各个阶段lncRNA、mRNA、circRNA和miRNA的表达谱进行了微阵列分析，构建了相应的共表达网络，为lncRNA在OC发生过程中发挥的潜在功能提供系统性的观点。Liu等[19]验证了lncRNAAK077216的表达在破骨细胞发生过程中显著上调，提示AK077216抑制NIP45的表达，且调节NFATc1的表达从而促进破骨细胞的形成和功能。Han等[20]发现，与健康人群相比，LncRNA TUG1在骨质疏松症患者血清中表达更高，过表达 LncRNA TUG1促进破骨细胞的增殖及抑制凋亡；采用siRNA敲低则取得了相反的结果，表明敲低LncRNA TUG1可能成为一个骨质疏松治疗的潜在靶点。此外，lncRNA还被发现参与调节细胞因子[21-22]、骨代谢相关信号通路[23]发生过程。

3 OP不同中医证型lncRNA的差异表达

中医将OP归入“骨痿”、“骨痹”等病症范畴，并且认为其发生与肾、脾和肝等脏腑功能密切相关。《素问·痿论》：“骨主身之骨髓，肾气热，则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿。”言之本在肾，病在骨。若禀赋素弱，或久病及肾，或年老肾气渐衰，皆可致肾气亏虚，难以化精气滋养骨髓，故肾虚是本病的主要病因。“骨痿”也与脾关系密切，若脾胃虚弱，气血乏源，则肌肉失养，骨骼失去肌肉的支撑则骨弱难支。此外，肝血不足，精血失养，肝肾精亏或阴虚失养也可致骨质疏松的发生。原发性骨质疏松症在临床上一般分为肾阳虚证、肝肾阴虚证、脾肾阳虚证、肾虚血瘀证等6种证型[24]。临床上以肾虚证为常见，治疗以补肾为主，故研究者们也大多从OP肾虚证的分子机制中探索。

本课题组[25]前期检测肾阴虚、肾阳虚证的绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)患者的lncRNA表达谱，筛选出肾阴虚、肾阳虚证组之间的差异表达lncRNA45条、差异表达mRNA35条，并构建了差异lncRNAs基因调控网络，同时分析得出LINC00334等8条共同差异表达的lncRNAs。生物信息学分析表明它们可能通过调控JAK/STAT、MAPK等12条信号转导通路来调节骨代谢平衡，从而参与肾阴虚证的发生发展过程[26]。在lncRNA芯片筛选的基础上，课题组进一步验证了lincRNAuc431+及其靶基因CLCF1在PMOP肾阴虚证中低表达[27]，且lincRNAuc431+可能对CLCF1负向调节。另外，课题组的研究[28]发现GAS5低表达可影响骨免疫相关细胞因子水平，从而通过对骨免疫通路的收缩影响骨代谢平衡，参与PMOP的发生和发展。这些研究表明了绝经后骨质疏松症肾虚证患者中lncRNAs存在差异表达，它们参与了骨质疏松症中医证的发生发展。

4 OP中医药治疗中lncRNA的调控

4.1 中医药干预OP模型对lncRNA表达的影响

现有研究[29-30]发现中草药的生物活性成分靶向非编码RNA，尤其是miRNA，lncRNA和circRNA，它们已成为许多疾病的新治疗靶标。lncRNA相关中药作用机制也已成为中医药研究的热点领域，多种中药可通过lncRNA发挥疾病治疗作用[31]。临床研究[32]表明中医药治疗OP已具显著疗效，同时越来越多研究也逐步深入中药调控lncRNA干预治疗骨质疏松症等骨骼疾病。柴爽[33]通过对去卵巢大鼠模型高通量测序后进行差异性分析，发现存在差异表达的17条lncRNA(9条上调和8条下调)和21条TUCP，对差异表达的lncRNA和TUCP进行靶基因预测发现其转录本预测到BMP家族，而进一步深入实验证实了骨疏康可以通过刺激BMP-2/Smads信号途径的活化来改善去卵巢大鼠模型的骨密度和骨微结构特性。张峰等[34]实验发现淫羊藿苷干预治疗能显著提高兔骨质疏松临床疗效，优化股骨MEG3、H19和DANCR/ANCR三者lncRNAs表达水平。Zhang等[35]研究发现经过薯蓣皂苷元(diosgenin，DIO)干预，抑制了卵巢切除术(OVX)引起的大鼠牙槽骨量丢失，结果显示在构建的共表达网络中关键lncRNA与mRNA的相互作用，且部分lncRNA可能通过骨代谢途径中的一些关键mRNA发挥作用，他们认为这种抗骨质疏松影响的机制可能在于DIO对lncRNA和mRNA表达谱的整体调节。

4.2 中医药调控lncRNA影响BMSCs成软骨、成骨分化

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一种有多向分化能力的细胞，经诱导下可向成骨细胞分化[36]，在骨质疏松症的发生起着重要作用。梁晶亮[37]实验发现左归丸含药血清在BMSCs成软骨分化过程中影响相关lncRNA的表达，利用基因芯片技术在表达谱中共发现5个lncRNAs显著上调，4个lncRNAs显著下调；李亮[38]则研究发现右归丸可能通过调控XR0072425等9个lncRNAs的表达来影响BMSCs的软骨分化。

张顺聪[39]实验验证了LncANRIL抑制细胞成骨分化因子的表达，并发现淫羊藿苷通过调控ANRIL-CDKN2B方式呈时间特异性的促进人BMSCs成骨分化。Fang等[40]发现活血通络胶囊通过抑制内源lncRNA-Miat的转录表达，从而促进大鼠BMSCs的成骨。Hou等[41]研究揭示了数个mRNAs和lncRNAs在中药活性成分(+)-cholesten-3-one诱导的成骨分化中起重要作用；当归多糖(angelica polysaccharide，AP)是当归的主要水溶性成分，Xie等[42]人发现AP以剂量依赖的方式上调了lncRNAH19的相对表达水平，反之抑制H19从而逆转了AP对细胞增殖和成骨细胞分化的促进作用。同时，姚顺晗等[43]发现罗汉果苷V通过促进LncRNATUG1表达刺激成骨细胞的增殖与分化。

中医药具有成分复杂、多靶点作用的特点，随着lncRNA与骨质疏松症分子机制关系的深入挖掘，中医药可通过调控lncRNAs发挥抗骨质疏松的作用机制更加清晰。但目前研究涉及临床试验尚少，仍需临床进一步验证补充。

5 展望

骨质疏松症是一种全身代谢性疾病，其产生可能与干细胞的成骨分化减弱、成骨细胞的骨形成作用减弱、破骨细胞的增殖及骨吸收作用增强和免疫调控等多种作用机制有关；lncRNA作为一种参与骨代谢生物学过程的重要因子，从多种水平在骨质疏松症发病机制中发挥重要作用。中医药治疗原发性骨质疏松症的原则是“辨证施治，病证结合，整体调节，防治结合”，治疗OP的过程中具有不良反应小、不良反应发生率低的优势[44]。但在长期使用过程中，仍需持续关注中医药使用的安全性问题，加强安全性指标监测，并且密切关注患者中医证候的演变，及时调整处方或对症处理。总之，OP中医证具有复杂、难以客观化及微观化的特点，而lncRNA已在部分证型中呈现不同的差异性表达；与此同时，中医药也可调控lncRNA的表达水平影响OP“骨吸收-骨形成”的过程从而达到治疗效果，由此推测lncRNA可能作为预测诊断及判断预后的指标以及治疗的潜在靶点，为深入探讨中医药治疗OP的机制研究提供新思路和新方法。