阴道自取样HPV检测的研究进展*

罗红学,王 悦,王建六

(北京大学人民医院,北京 100044)

1 自取样HPV检测的背景和概念

高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus,hrHPV)持续感染是宫颈癌发病的必要条件。诸多研究证实,HPV病毒分子的检测技术具有比细胞学更高的高级别宫颈病变筛查敏感性,并且能提供更好的阴性预测值保护,延长筛查间隔时间。目前,HPV检测已从辅助细胞学开始逐渐替代后者成为宫颈癌初筛的主要手段[1]。HPV检测的另一个重要优点是,它对样本质和量要求较低,故而可采用阴道自取样。所谓自取样是指患者自行将取样器插入阴道采集的宫颈/阴道脱落细胞样本,即自取样本,可通过邮寄或集中送检方式到达检测机构,省时省力、简单方便,该取样模式免除了由临床医生在医院以妇科检查方式收集患者宫颈脱落细胞样本(医取样本)及其所必需的医疗成本,具有大幅度提高筛查覆盖率的能力,尤其是在医疗资源匮乏和宗教文化抵触的地区。已有大量证据表明,自取样HPV检测优于细胞学,与医生取样HPV检测相比,HPV的检出率和亚型分布具有很好的一致性,在高级别宫颈病变检测敏感性方面也相当[2]。近年来,宫颈癌自取样筛查的研究除了在验证适合的检测技术方面有较大进展外,自取样的取样方式、取样工具、样本的保存形式,乃至自取样本的来源、自取样筛查的开展和组织形式等各个方面也有很多研究和报道,现就自取样宫颈癌筛查研究进展做综述性介绍。

2 阴道自取样HPV检测技术

第二代杂交捕获技术(Hybrid Capture 2,HC2)作为最早,也是最多被用于自取样研究的非聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)基础的HPV检测技术,其原理是利用对抗体杂交捕获放大和收集化学发光信号来实现对HPV相对含量的测定[3],但采用不同方式采集的阴道自取样本进行检测,敏感性均不如细胞学。对于自然人群CIN2+的检测,自取样敏感性仅为医生取样的62%～87%[4]。另一种基于杂交捕获原理的HPV检测方法,CareHPV检测技术,也被证实仅能达到80%敏感性[5]。Cervista作为继HC2之后的第二个被批准用于辅助细胞学筛查的HPV检测方法,检测原理是基于HPV-DNA酶切扩增和信号放大技术[6],但应用于自取样在检测CIN3+时,仅有71%左右的敏感性[2]。Aptima是源于Hologic公司的一种新型HPV检测技术,针对的是HPV致癌基因E6和E7的mRNA,虽然不是基于PCR的检测技术,但是检验过程中,在目标捕获完成后,mRNA将会通过转录介导核酸扩增方法(TMA)得以扩增。Dockter等[7]开展的一项多中心对照研究结果显示,该方法和HC2相比,敏感性相当,特异性更高。但是在两项非洲研究中,Aptima方法用于检测自取样本,对HSIL病变的敏感性均低于医生取样的80%[8]。个别非PCR基础上的检测方法如DNA Chip等,检测自取样本获得了较医生取样略高的CIN3+检测敏感性(90.5% vs 88.1%),但研究的对象不是自然人群[9]。

2010年Wu等在一项横断面的大人群宫颈癌筛查研究SHENCCAST-II项目中,首次将一种基于多重PCR的基因分型加质谱平台检测技术MALDI-TOF-MS应用于自取样的检测,获得了与医生取样同样高的CIN3+检测敏感性(94.3% vs 94.3%),由此证实以PCR为基础的HPV检测技术是自取样检测成功的关键[2]。随后另外几种基于PCR的检测方法 HR GP5+/6+、SPF10LiPA、Abbott RT HPV PCR 等被不同实验证实与自取样本联合使用也可达到与医生取样相当的检测效果,但均不是在人群筛查的研究背景下完成的。

Cobas 4800 HPV即罗氏4800,是一种集自动样品制备与实时聚合酶链反应(Real-Time PCR)、扩增和检测的多重定性技术,它能单独输出HPV16和18两种亚型的结果和其他12种高危型别的混合结果,是目前唯一被美国FDA、欧盟CE及中国CFDA共同认证的可用于宫颈癌初筛的HPV检测技术。Stanczuk等[10]在2016年完成的PaVDaG研究中报道了Cobas 4800 HPV检测阴道自取样本与医生取样相比,对CIN2+/CIN3+的相对敏感性均可达97%。2014年,Yi等[11]报道了一种新型的基于新一代基因测序技术的HPV分型检测方法(SEQ HPV),可高通量检测14种高危型HPV并精确分型。这种HPV测序分型检测技术与HC2检测医生取样金标准的HPV检测一致率达95%以上,CIN3+检测敏感性约97%,与HC2检测医生取样比较,差异无统计学意义。Du等[12]最近一项基于多中心万例自然人群的自取样项目(CHIMUST)研究证实,上述Cobas 4800及SEQ HPV分型技术检测不同形式的阴道自取样本与医生取样之间的HPV检测一致性较好,CIN2+/CIN3+检测敏感性不逊于后者。

3 阴道自取样本采集和样本转运工具

阴道自取样本较常规医生取样获取的样本细胞数相对较少,其病毒含量达不到多数基于信号放大的HPV检测方法的最低检测阈值。因此,采用适合的以PCR为基础的HPV检测技术是自取样能成为有效筛查手段的第一步。此外,与之相匹配的自取样方法和样本保存形式也非常关键。同一种检测技术针对不同工具采集的自取样本,其HPV检测一致性和CIN2+/CIN3+敏感性均存在不小差异。

拭子(Swab)是可选的自取样采集工具之一,其形似小棉签,头部由砂纸、聚酯纤维或棉质材料卷裹,临床常用于外伤清创和皮肤上药。干燥拭子一般保存在塑料小包中,湿拭子常配套装在有转换液的小管里。最新研究报道,用Cobas 4800和Abbott RT HPV两种方检测,干湿拭子之间的HPV一致性达90%[13],取样完毕后,将拭子放入干燥塑料管,亦可置于装有磷酸盐缓冲液的无菌冻存管里。含自取样本的干燥拭子可在低温下保存3个月以上。有综述报道,拭子自取样本的敏感性74% ～81%,特异性88% ～90%[14]。细胞刷(Brush)是最常见的一种自取样装置之一,刷头可有不同形状,但一般由硬毛组成。目前市场上有多种产品,如Evalyn刷、Viba刷及锥形刷等。Evalyn刷的相关研究提示,其所取自取样本与医生取样相比,HPV检测一致性约85%[15]。自取样刷小巧柔韧便于使用,可干燥储存和运输,有研究报道自取样干刷样本保存8天左右再行检测,其结果与常规医取样仍具可比性。阴道塞(Tampon)由圆柱形的有吸收能力的材料构成,在月经期可塞进阴道用于吸收经血。完整阴道塞装置还包括一个用于推送的敷料器或塑料管,常见的如Fournier自取样阴道塞。阴道塞可收集大量的细胞碎片,包括宫颈和阴道壁的鳞状上皮细胞。对于CIN患者,其吸收的细胞样本检测结果与其放置在阴道的时间无明显相关性。有综述报道阴道塞的诊断敏感性67% ～94%[14]。也有学者将护垫(Pad)作为自取样工具,通过收集检测护垫表层的经血滤析成分来实现筛查宫颈病变的目的。Kim等[16]研究结果显示,对于CIN的检测敏感性,护垫所采集的经血样本为76.9%,与常规医生取样相比,其一致性达97.8%。

固体洗提卡(Solid elute Card)是美国GE公司生产的FTA卡,临床用于新生儿出生缺陷的筛查及病毒(如HIV)和热带病检测[17],其主要部件是一张具有自动裂解细胞并吸附保存病毒DNA能力的滤纸,该滤纸片因含有变色试剂成份故可指示样本涂抹部位。该卡片可用于储存和转运样本。自取样本可经细胞刷或拭子获取后涂抹在卡片上,通过打孔得到小的滤纸片,再经简单的加热洗涤步骤即可获得检测用DNA[18]。研究表明,FTA卡保存的阴道自取样本与自取样的液体标本、医生取样之间的高危型HPV检测一致性较好[19]。Maurer等[20]报道了一种新型的固体洗提卡“POI卡”,其构造类似FTA卡,但该卡对CIN2+敏感性显著高于FTA卡(74% vs 95%),其潮湿环境下稳定性更好。固体卡轻巧方便利于自取样本的保存和运输,同时还有防止样本污染的设计,配以合适的取样细胞刷,在自取样研究中有巨大潜力。

4 尿液样本的HPV检测用于宫颈癌筛查

尿液作为一种容易获取、非侵入性的检测样本近来也被用于自取样筛查研究以及疫苗接种后的随访研究。据报道,尿液自取样本与宫颈细胞样本相比,HPV检测敏感性能达到后者的89%[21],尿液自取样本对阴道镜回访者CIN2+的检测敏感性能达92%[22]。最近一项用Cobas 4800作为检测技术的小样本配对实验的结果也显示,医生取样和晨起初尿自取样本之间的HPV检测一致性为88%,以前者为金标准HPV敏感性为90.5%,以病理结果为金标准,对CIN2/3敏感性达95%[23]。HPV病毒的核酸分子到达和存在于尿液中的机制尚不明了,各项研究的背景也不尽相同,针对尿液的HPV检测程序和方法目前缺乏统一的标准。尿液检测另一个缺点是其中的HPV病毒核酸分子并非明确来源于病变初发部位,其诊断提示意义尚有争议。

5 自取样HPV检测筛查宫颈癌的模式

虽然自取样的方式省去了阴道检查的医生操作步骤,患者在家中收集样本后邮寄至检测中心即可完成筛查,但是具体实施中还涉及妇女对筛查的认知,个人信息的登记核实,申请参与和获得取样器的流程,以及对自取样操作步骤的了解。网络信息技术和移动通信设备为此提供了支持,如专业的门户网站、社交平台,国外的FaceBook,国内的微信朋友圈及公众号等,均可以很方便地实现筛查相关知识的宣传普及、登记申请、物流追踪和检测结果查询。Nelson等[24]运用互联网建立招募平台完成自取样研究显示,研究对象对于自取样的接受度、舒适度的评价均远远高于未取样者。然而此项研究主要针对的是21～30岁年轻女性,对于信息技术的了解和运用熟练程度强于老年女性。换言之,基于互联网的自取样筛查模式能够增加的筛查人口可能主要是来自城市年轻女性群体,这部分女性有较高的教育程度和经济收入,之所以未能参加筛查,除了对宫颈癌防治知识不够了解外,主要原因可能是没有时间、害怕麻烦或羞于妇科检查。但自取样筛查的模式的开展不能局限于城市家庭式的个人取样和邮寄,因为影响整体筛查覆盖率的还是那些经济状况落后的偏远地区和不熟悉网络技术的未筛查妇女。Belinson研究团队在人口密集的发展中国家构建和评价了一种基于社区的自取样筛查模式,通过联合筛查地区的权威组织机构,培训社区工作或村委工作的非医务人员,并在热衷群众活动的积极分子帮助下,成功实现了农村地区由点及面的大人群自取样筛查运动。集中教授自取样方法成功完成八千余例妇女的筛查,后期阳性回叫率达到了84.3%[25]。这种基于社区的自取样筛查模式成功关键很大程度依赖社区人员的责任心、工作热情和积极性,取样过程存在很多变量。另一个重要问题是可能难以获得筛查妇女的完整身份信息和病史记录,可能导致重复筛查,对于检测中心来说检测信息的录入也非常耗时。Wu等[26]在网络自取样筛查模式的基础上尝试探索了网络与社区相结合的自取样筛查模型,成功募集到预期数目的筛查人群,并实现了城市与农村地区筛查妇女的线上登记。在此模型中,社区工作人员仅需要集中筛查人群,协助他们登陆筛查中心的网站、填写个人信息、获取筛查编号、发放和邮寄自取样器材。参与筛查的妇女可从网站上悉知筛查相关的所有信息,包括取样视频指导,检测报告解读,以及进一步就诊指引,为上述问题提供了可参考的解决方案。

6 自取样存在的问题

除尿液自取样和护垫/月经血自取样完全无创外,其他的阴道自取样方式因为都需要将取样工具插入阴道,所以都具有一定的潜在风险和危害。阴道自取样工具使用者必须要具备基本的文化水平,能够阅读理解取样指示图谱或步骤。不按照取样流程随意操作或错误操作不仅无法取得满意样本,还会带来一些医疗风险,轻者或可能穿破阴道黏膜导致出血引起心理压力,重者可能感染(中毒)性休克。来自国内的一项研究显示,教育程度可能是影响妇女接受自取样的主要原因[27]。避免生硬晦涩医疗术语,使用简单易懂的温馨的图文宣传册、视频指导都可实现这一目的。此外,还需考虑到一些肥胖的妇女、解剖学异常的妇女和阴道萎缩的老年妇女,并不能适用任意自取样工具,需根据情况个体化选择和研发新的采集工具。

需要指出的是,由于自取样的“自取”性质,无论采取哪种取样工具或样本保存介质,自取样标本都不可能是单一来源的阴道壁细胞或宫颈脱落细胞。虽然有研究结果显示,宫颈细胞以及阴道壁细胞的HPV检测结果有良好的一致性,但未来当特异性分子标记物成为疾病预测一个重要指标和方向时,自取样的标本不一定依然适用。

7 自取样HPV检测展望

自取样HPV检测虽然在检测高级别宫颈病变的敏感性方面优于细胞学,甚至接近医生取样HPV检测的结果,但是同样存在所有HPV检测共同的特异性较差的问题[28]。医生取样在HPV检测结果阳性时,可以用同一样本进行细胞学检测以实现风险分层和二次筛查,但自取样本已被证实无法获得满意细胞制片,细胞学检测效果差[29]。所以患者仍需再次前往医院采集满意细胞学标本。美国癌症协会(ACS)2015年发布的宫颈癌筛查临时指南开始推荐使用HPV16/18作为HPV阳性的分流指标[30]。目前多数自取样筛查研究中涉及的基于PCR的HPV检测技术,如Abbott RT HPV、MALDI-TOF-MS、Cobas 4800 HPV、HPV基因测序分型检测技术(SEQ HPV)等均可报告HPV16/18的分型或其他单独的高危亚型结果,因此结合不同地区HPV亚型与宫颈癌发病的相关程度,对这部分自取样HPV16/18或其他高危亚型阳性进行分流和平衡筛查敏感性和特异性,提高筛查效率[31]。最近有研究报道,人类某些基因的超甲基化与宫颈癌的发病有强相关性,或可应用于自取样本的 HPV阳性分流[32]。p16/ki67也是最近研究较热的一组分子标记物,细胞免疫双染对HPV感染者CIN2+/CIN3+的检测有较高的敏感性和特异性。由于该分子染色不依赖细胞形态学,所以可适用于数目和质量均要求不高的阴道自取样本的检测,未来有很大潜力成为自取样HPV检测阳性者的分流参考指标之一[33-34]。HC2虽被证实并不适用于自取样本的检测,但其检测结果可反映出HPV感染的相对病毒载量,鉴于病毒载量与宫颈病变级别的高相关性[35],最近也有学者认为病毒载量检测可用作HPV分型检测后的二次筛查补充,这样既可回避HC2检测自取样本的不敏感性,又可利用高病毒载量的对高级别宫颈病变的特异性,从而优化各项筛查效果评定指标[36]。在此基础上,Wu的研究团队最近报道,可将Cobas 4800检测中反映病毒拷贝数的循环阈值(Ct值)作为反映HPV病毒载量的指标,设定特定阈值进行对HPV阳性者的分流,并获得了理想筛查效率[37]。上述研究为实现零细胞学的自取样HPV检测宫颈筛查模式提供了方向。

综上所述,自取样HPV检测因其经济、方便、安全、保护隐私以及检测准确等诸多优点,在提高宫颈癌筛查覆盖率、HPV疫苗接种或宫颈病变患者干预后的随访等方面具有巨大潜力和应用价值。然而,自取样HPV检测作为初筛手段的宫颈癌筛查模式的建立,首先需要优化组合自取样本的采集、保存、检测等各个环节。同时,在推广实施前,还需要有经过验证的、合理有效的阳性者的分流方案来平衡筛查和卫生经济学效益。