间充质干细胞移植有效性研究进展

李晓宇，王会倩，朱保伟，赵 明，谢则平，张淑敏

(1.烟台赛泽生物技术有限公司，山东 烟台 264670；2.山东国际生物科技园发展有限公司，山东 烟台 264670；3.滨州医学院药学院，山东 烟台 264003)

随着间充质干细胞(MSCs)基础研究的深入，其临床适应症涵盖了慢性病、神经系统疾病、血液病等。然而阻碍干细胞临床有效性的关键在于干细胞移植后出现的细胞存活率偏低，整合及归巢效果不良，细胞分化率低，体内存活时间较短以及免疫调节能力不足等。因而，解决MSCs移植成功率的问题成为干细胞临床应用的关键。文章结合目前MSCs基础及临床研究的热点，综述了MSCs与药物、细胞因子、材料支架、物理因素等方法联合应用并辅以适合的输入方式和剂量，以提高MSCs移植有效性，为后续MSCs临床研究方案的制定提供了参考依据。

1 MSCs应用概述

MSCs具有很强的自我更新能力和多向分化潜能，可来源于骨髓、脐带、脐带血、胎盘、脂肪等。其中骨髓来源MSCs发现最早且研究的最为深入，而脐带血来源的MSCs由于其易于获得，应用也越来越广泛[1]。目前具有潜力的MSCs是脂肪间充质干细胞(ADSCs)，因为脂肪来源广泛且易获取[2]。有研究比较了来自7种不同来源的MSCs在成骨方面的应用，结论是ADSCs和骨髓间充质干细胞(BMSCs)同样具有显著效果[3]。

MSCs是继造血干细胞之后又一类广泛开展临床试验的干细胞。通过美国NIH(National Institutes of Health)下属的ClinicalTrials.gov数据库检索发现，截止到2020年8月底，全球关于MSCs临床研究项目超过9 000余项。然而由于MSCs移植后较差的细胞存活率，加之移植后在靶向组织中检出率低、分化效率差以及体内存活时间短等问题[4-6]，会直接影响MSCs治疗效果。因此，如何提高MSCs临床治疗效果成为一个重要的研究方向。

2 MSCs联合应用提高移植有效性

文章总结了通过预处理MSCs或者将MSCs与生物材料/分子共同植入，人为创造MSCs微环境，可以诱导细胞增殖、定向分化，从而提高细胞存活率、改善归巢效应、延长细胞作用时间、增强机体免疫调节能力等，提高MSCs移植效率。

2.1与药物联合应用：MSCs与药物共同使用或者通过药物预处理MSCs，可以改善输入环境，触发相关信号通路等，从而增强MSCs移植效率。研究发现，在实验性结肠炎小鼠模型中，肝素与骨髓间充质干细胞(BMSCs)联合应用可以有效增强BMSC的治疗效果，是因为肝素(400 U / kg)进行抗凝治疗可减少BMSC肺栓塞以及BMSC肺部清除率，从而提高细胞存活率，并增强BMSC在细胞治疗中向靶器官的迁移和维持，提高干细胞治疗效果[7]。研究表明，地西他滨药物可激活IL4R / STAT6 / STAT3 /PPARγ信号通路，从而调节机体免疫反应，脐带间充质干细胞(UC-MSC)与地西他滨联合使用可以减少炎症反应，提高胰岛素敏感性，较单纯UC-MSC治疗可起到长期降糖的作用[8]。某些相关化合物的添加还可以激发信号通路，促进细胞迁移相关物质的表达[9]。铁螯合剂去铁胺预处理BMSCs可以通过增加缺氧诱导因子1α(HIF-1α)蛋白的稳定性，从而影响某些趋化因子受体以及所涉及的蛋白酶来增加BMSCs的归巢效应，最终改善MSCs治疗效果[10]。

2.2细胞因子预处理：细胞因子作为一种信号分子在MSCs增殖分化过程中起着至关重要的作用。细胞因子按生物学活性不同主要分为以下几类：白细胞介素(IL)、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、造血生长因子(HGF)、集落刺激因子(CSF)等[11]。由细胞因子信号引起的具体细胞反应会引导一系列细胞行为，包括影响细胞的生存、促进细胞增殖和分化、影响细胞迁移等。除此之外，还具有明显的免疫调控能力。而MSCs免疫调控能力的激活需要一定的组织微环境。细胞因子预处理MSCs不仅可以提高干细胞的增殖能力和分化潜能，还可以调节MSCs发挥免疫抑制或增强的作用、改善体内微环境等，从而优化MSCs治疗效果。

研究发现，含有碱性成纤维细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养的毛囊来源的间充质干细胞(HF-MSC)，可以极大提高HF-MSC高增值和多分化的潜能[12]。肥大细胞颗粒预处理hUCB-MSC可以使组胺介导COX-2信号通路上调，从而调节变态免疫反应，提高hUCB-MSC对特应性皮炎的治疗效果[13]。白介素-1β和干扰素-γ预处理人脐带血间充质干细胞(hUCB-MSC)可通过增强前列腺素E2的分泌和吲哚胺2,3-双加氧酶活性，增强hUCB-MSC免疫调节能力，在硫酸葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎模型中较单独hUCB-MSC 治疗效果更佳[14]。

目前，细胞因子的使用不再仅仅是直接溶于培养基中，更多的是通过化学的方法使其绑定到细胞基质以及支架材料上，或者通过物理方法将其封装，定点释放生物活性因子。其中物理方法应用更为广泛，因为他不需要有能与细胞因子共价结合的位点[15]。

2.3MSCs与支架材料的复合使用：MSCs的归巢效应主要是通过干细胞表面与目标物的受体或配体结合来驱动的[16]。一些生物相容性好的支架材料的作用不仅能够起到结构支持的作用，还能提供精确的物理或化学信号进行细胞的信号交流实现干细胞的归巢，促进干细胞与宿主组织的整合。除此之外，MSCs还具有诱导分化的作用，并且可以通过传递基因或药物延长细胞存活时间提高多种疾病的干细胞治疗效果[17]。目前，支架材料在细胞再生及组织工程领域应用广泛。其中最具前景的组织再生方式就是利用支架材料在受损部位控制趋化因子的方向，并延长趋化因子对干细胞归巢效应的时间，从而促进组织的再生。

MSCs与支架材料在各个组织修复领域应用广泛。在神经损伤修复方面，人骨髓间充质干细胞(hBMSC)和含有成纤维细胞生长因子(FGF-2)的纳米球材料共同移植，可以增加hBMSC增殖及其细胞存活率，并显著提高脊髓损伤大鼠模型的治疗效果[18]。在软组织修复方面，将脂肪来源的MSCs 移植于藻酸盐支架上，可以提高MSCs分化为脂肪细胞的效率，并显示出血管生成活性，从而用于字体软组织修复[19]。在创伤修复方面，hUCB-MSC与胶原纤维蛋白双层膜结合对小鼠伤口愈合的实验中可以加速伤口的愈合[20]。在成骨方面，将hUCB-MSC与多孔丝素蛋白(SF)/壳聚糖(CS)支架[21]或仿生矿化胶原蛋白支架[22]联合使用，其增殖能力、成软骨分化能力、归巢能力明显提高，促进体内骨缺损的修复速度；含重组人类转化生长因子-β3(rhTGF-β3)的核-壳纳米纤维支架可以促进人脐带华通胶来源的间充质干细胞(WMSCs)的成软骨分化能力，从而提高WMSCs在组织工程化气管软骨构建中的应用[23]。由此可见，支架材料与干细胞联合应用在神经损伤修复、软组织修复、创伤修复、骨损伤修复等方面显示出突出效果。

2.4物理因素预处理：物理因素预处理MSCs主要是指低氧预处理以及冲击波疗法(ESWT)。众多研究人员将常氧(21% O2)与低氧(1% O2)培养环境进行对照研究，表明，低氧预处理可以显著影响干细胞的旁分泌功能[24]，从而促进作用细胞的增殖、迁移和小管形成等作用[25]。此外，低氧预处理可能诱导参与细胞迁移的一些基因表达，并且可以改善细胞的存活、增殖和治疗潜力[26-27]。研究发现，低氧预处理MSCs在体外可以提高细胞存活率以及促血管生成因子的表达，在治疗食蟹猴心力衰竭时，实验组较对照组心肌梗死情况及心室功能恢复更好，并能延长干细胞治疗作用[28]。

冲击波(ESW)作为一种物理因子，具有不良反应小、无创、操作简便等优点。ESW是利用液电转化和传递的原理，在不同密度组织之间产生能量梯度差及扭拉力，来实现治疗的目的[29]。研究表明，ESW可以诱导MSCs增殖分化，其分化电压多为5kV或8.5kV，频率多为1.7Hz或2Hz[30]。在细胞增殖方面，使用总剂量为2 000次的中高能量作用3～8 d，可使培养的细胞数量明显增多。研究发现，ESW与自体脂肪来源的间充质干细胞(ADMSCs)联合应用，较单独ESW及ADMSCs治疗，能够增加了骨形态发生蛋白(BMP)-4的表达，可以显著提高ADMSCs的增殖分化，在早期膝骨关节炎的治疗中具有协同促进作用[31]。在雄性小猪急性心肌梗塞模型中，将ESWT和骨髓间充质干细胞(BM-MSC)联合应用，在改善左心室功能障碍方面优于单独的BM-MSC治疗[32]。

3 MSCs输入方式及剂量对移植有效性的影响

在任何新型治疗剂开发过程中的重要阶段是确认最佳剂量和给药途径，同理，影响MSCs治疗效果的因素也包括细胞输入方式以及输入剂量。关于输入方式，MSCs的大多数研究都采用静脉输入[33-34]，临床上普遍认为静脉输入是安全的，输入后发热是唯一可能发生的不良反应[35]。研究发现，小鼠静脉输入MSCs后会在肺部蓄积再迁移到血管外，其中一半以上滞留肺部的MSCs会被组织巨噬细胞迅速吞噬[36]，移植效率也会因此而降低。除了静脉输入外，在许多多发性硬化症的研究中是采用鞘内注射来进行的[37-38]。除此之外还可针对患处进行定点注射，例如对关节炎患者进行关节内注射人脂肪间充质干细胞[39]，对心脏病患者通过冠状动脉[40]输入及心内膜注射[41]的途径等都可以达到治疗的效果。

众多研究表明，MSCs细胞移植剂量并非越多越好[42]，其剂量高低可以影响干细胞增殖、分化并引起宿主体内微环境变化、表达谱差异等。普遍来讲，向啮齿动物体内静脉输注MSCs时，其剂量通常为5×107个细胞/kg，人体中MSCs的输入剂量通常为1×106-2×106个细胞/kg，不超过1.2×107个细胞/kg[43]。关于定点注射，输入量因病种不同而产生差异。在一项人脂肪来源的间充质干细胞(haMSCs)治疗骨关节炎的临床试验中，关节内分别注射低剂量(1×107)、中剂量(2×107)、高剂量(5×107)的haMSCs，结果显示高剂量组治疗效果更好[39]。然而该项研究除了证明关节内注射haMSCs具有安全性和有效性之外，由于研究的样本量较少，偏差较大，因此也存在一定的局限性。而另一项研究发现，向心肌梗塞的猪模型心内膜输注低剂量(2.4×107)、中剂量(2.4×108)、高剂量(4.4×108)的MSCs，结果显示梗死面积显著减少，但是治疗效果与输入剂量的高低没有相关性[44]。综上所述，MSCs的输入方式及输入量在细胞治疗领域缺乏一致可靠的数据，在进行关键临床试验之前可能需要进行其他临床前研究或小样本量研究。

4 总结与展望

MSCs在再生医学领域具有广泛的应用前景，合理选择治疗方案可以提高MSCs临床有效性。通过MSCs与药物、细胞因子、支架材料、物理方法等联合应用，并选择合理输入方式及剂量等，改善移植宿主的微环境，激发细胞迁移相关信号通路，提高移植细胞的存活率及分化效率，整合归巢，作用时间及免疫调节能力等，可以极大提高MSCs移植效率。目前干细胞应用逐渐由动物实验慢慢向临床转化，在转化过程中仍需不断改善干细胞培养方式，尽可能减少移植后并发症的问题以及干细胞来源的伦理问题等，以期用最简便、高效、微创的方式解决复杂的组织再生问题。在未来MSCs治疗中应当更倾向于患者个性化治疗，为不同个体、不同阶段的患者选择合适的MSCs类型和最佳应用方案[45]。