环状RNA在肿瘤耐药中的应用*

蒋灿灿，周淑萍

[安徽理工大学第一附属医院(淮南市第一人民医院)，安徽 淮南 232000]

癌症作为世界性公共卫生健康威胁的主要原因之一，具有高病死、高复发、高转移和预后差等特点。根据2018年全球癌症统计，全球新增癌症病例1 810万例，死亡的病例数高达960万[1]。尽管手术切除、放化疗、免疫治疗、内分泌治疗及靶向治疗等临床应用手段在癌症的治疗方面取得了一定进展,但癌症患者的存活率仍然较低，造成这一后果的原因多是早期诊断率低及无有效的预后评估手段。目前抗癌常用的治疗药物和方案包括：索拉非尼、阿霉素(Adriamycin,ADM)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)、含铂抗癌药物、免疫治疗等[2-5]。这些传统疗法仍是现今主要治疗形式，但这些药物在治疗后期多会使癌细胞产生药物抵抗，并由此产生治疗成功率降低，预后不佳的后果。肿瘤药物治疗过程中出现的耐药机制繁而复杂，目前研究出的可能机制包括肿瘤干细胞非正常性激活、化疗药物代谢速度增加、DNA损伤后修复能力增强、细胞凋亡信号通路活性丧失、细胞内药物积聚被重新分布及转运体(识别和排出药物)的表达增加等[6-8]。

环状RNA是一种内源性RNA，由前体RNA经反向剪接或选择性剪接形成的单链环状结构，其特征是在真核生物中具有较高的序列保守性、表达特异性及高度稳定性等。与其他线性RNA相比，环状RNA所特有的闭合环状结构，使其无游离端，不易被核糖核酸酶剪切，难以被许多典型的RNA降解途径降解，故可在体内稳定存在[9]。研究表明，大多数已测序的环状RNA比线性RNA具有更长的半衰期，特别是在永久性细胞中，例如，随着年龄的增长，环状RNA会在神经细胞中大量富集[10-13]。此外，一些环状RNA可以促进或者抑制靶基因的表达，这主要是因为其部分片段上含有与miRNA相结合的位点，可通过碱基互补配对原则结合miRNA，阻止miRNA与目标基因结合，共同调控靶基因的表达[14-15]。目前已证实体内的miRNA可调节几十到上百个基因的表达，以及同时控制多个细胞途径的下传，在基因组中起主要调节作用。在癌细胞中，一些miRNA的调控作用经常被解除，随之出现细胞原癌基因逃脱miRNA介导的抑制，获得独立于原癌基因本身的突变功能[16-17]。随着对miRNA研究的深入，已发现miRNA不仅在癌组织和细胞中差异性表达(上调或下调)，并且还参与癌细胞的生长浸润、远处或多处转移、细胞耐药等[18-22]。基于miRNA的一系列作用，有研究者提出构建miRNA模拟物作为治疗肿瘤的药物，系统或局部地将模拟物注射到目标组织部位，但血流中易降解，靶向性不佳以及局部传递困难等问题，是目前需要面对的挑战[23]。与miRNA易降解、寿命短、不稳定等缺陷相比，环状RNA不仅可在体液(唾液、血液及组织液)中稳定存在，而且具有复制保守性。因此通过circRNA/miRNA轴改变靶基因的表达量，纠正细胞缺陷所致的癌细胞过度增殖，并促进凋亡途径的激活以及癌细胞死亡，是目前科研工作中需考虑的方向之一。除此之外环状RNA还有蛋白质翻译、基因转录及转录后修饰等作用[14,24-26]。针对环状RNA特有的结构、功能及作用机制，其有成为肿瘤预防、早期诊断、治疗靶点确认、疗效评估及预后评估的分子标志物的潜力。

1 环状RNA的生物学特征

早在20世纪70年代，Kolakofsky首次在仙台病毒中发现了单链的、闭合环状的、无蛋白质外壳的一种RNA分子，但因认识的不足，以及测序技术的匮乏，最初认为其是转录过程中错误拼接的产物，随着高通量测序技术及生物信息技术的快速发展，才改变对环状RNA结构的错误认知[27]。环状RNA除了多数来自外显子外，还有少部分分别源于3'UTR、5'UTR、内含子、基因间区以及反义RNA。根据环状RNA的组成序列及结构的不同，可将其分为外显子circRNA、内含子circRNA、外显子-内含子circRNA和基因间型circRNA，其中，外显子RNA占据所鉴定出的circRNA的80 %[28-29]。科研工作者在对环状RNA的生物学特性，及其在肿瘤发生及发展中所发挥的作用进行了一系列研究后，提出了以下几点认识：首先，环状RNA几乎在所有的组织和细胞中都差异性表达，包括肺癌、胃癌及泌尿道肿瘤等[30-34]；其次，同一肿瘤中，不同的circRNA表达方式也存在差异，而简单的上下调方式已难以满足其表达需要，例如在胃癌中，circHIPK3和circPVT1表达上调[30-31]，而circLARP4表达下调[32]；第三，相同环状RNA在不同肿瘤中表达也不相同，并且其上下调模式也不相同，例如，circHIPK3在绝大多数癌症中的表达都是上调的[30,33]，但在膀胱癌中它是下调的[34]。具有复杂表达模式的环状RNA，在生物学功能及临床应用中也展示了其复杂的一面。环状RNA除了调控肿瘤生长浸润、远处或多处转移以及肿瘤周围血供增加等作用外，还与癌症的各种临床表征及患者预后相关[35-36]。环状RNA与肿瘤临床治疗的相关性提示了其潜在的临床诊断价值，例如，低表达的circNOL10可能暗示该肺癌恶性程度不高，预后良好[37]；而circDONSON的高表达则提示该胃癌患者出现淋巴结转移，需加强重视[38]。综上所述，环状RNA在肿瘤的早期诊断、治疗及预后中有重大意义。

2 环状RNA与药物耐药

目前，靶向治疗、化疗、免疫治疗及内分泌治疗等仍是癌症相关疾病药物治疗的主流。如分子靶向药物常用药剂包括索拉非尼、瑞格拉非尼等。而常用的临床化疗药物有阿霉素、5-氟尿嘧啶、顺铂和奥沙利铂。至于肿瘤的免疫治疗，它是一种新的治疗选择，主要包括免疫检查点阻滞剂：程序性死亡受体-1(Programmed Cell Death-1,PD-1)、程序性死亡受体配体-1(Programmed Cell Receptor-ligand 1,PD-L1)等。而肿瘤的内分泌治疗则主要是针对雄激素及雌激素受体的药物，其中广泛使用的药物为苯扎鲁胺、他莫昔芬等。

环状RNA是作为一种内源性RNA，在体内大量富集，并可能以差异性表达的方式在组织和细胞中存在。最近，环状RNA被证明在一些细胞生长的各个过程中发挥调节作用，如miRNA“海绵”、RBP结合分子、转录调节因子、蛋白质翻译以及免疫调节因子等[39-40]。新的证据表明环状RNA除了调控肿瘤生长、转移以及增加血供等作用外，还与癌症的各种临床表征及患者预后相关。本文从肿瘤耐药的角度探讨环状RNA的作用、功能及机制，以期为临床治疗提供新思路。

2.1环状RNA与阿霉素耐药 阿霉素作为抑制细胞周期的抗癌药物，在临床上广泛使用，其潜在作用为:抑制DNA复制合成，干扰复制所需的拓扑异构酶Ⅱ活性，并参与诱导线粒体自由基损伤等[41-42]。在多种癌症的黄金治疗方案中，阿霉素是治疗的关键要素之一，然而，其抗癌作用随着长期暴露于浓度梯度中而逐渐减弱，最终形成多药耐药[43-44]，但随着对环状RNA的了解愈加深入，其在阿霉素耐药方面存在的潜在临床诊疗价值也随之彰显。有研究者在乳腺癌患者的癌细胞中发现了一种名为circKDM4C的环状RNA，此命名是因其来源于赖氨酸去甲基化酶4C(Lysine Demethylase 4C,KDM4C)基因。体内外实验中证实了在乳腺癌细胞和组织中circKDM4C的表达较正常细胞和组织下降，并且其低表达会影响乳腺癌的预后和转移。通过流式细胞仪和Western印迹分析得出，circKDM4C基因敲除可抑制阿霉素诱导的细胞凋亡，而circKDM4C过表达可促进细胞凋亡。进一步的实验得出，低表达的circKDM4C可通过与miR-548p相互作用，抑制靶基因吩嗪生物合成类蛋白质结构域(Phenazine Biosynthesis Like Protein Domain Containing,PBLD)的表达，最终导致病情进展以及化疗耐药性增强。此研究提出了乳腺癌患者潜在的治疗靶点可能是circKDM4C/miR-548p/PBLD轴[45]。此外，骨肉瘤患者的组织、血液和化疗耐药细胞中，circPVT1显著上调，但敲除circPVT1后可降低经典耐药相关基因ATP结合盒转运体B1(ATP Binding Cassette Transporter B1,ABCB1)的表达，从而增加了骨肉瘤细胞对阿霉素和顺铂的敏感性[46]。在不影响体内其他RNA表达的情况下，若能精准调控致癌环状RNA，使其转变为具有治疗意义的RNA药物。如上述，circPVT1在非小细胞性肺癌及骨肉瘤中表达上调则会导致多重耐药，若研发一种能靶向于circPVT1的RNA药物抑制其表达，便可解决肿瘤细胞或组织的耐药性问题[46-47]。

2.2环状RNA与5-氟尿嘧啶(5-FU)耐药 5-氟尿嘧啶(5-FU)是一种细胞周期抗代谢化疗药物，其抗癌机制为：干扰DNA合成，促使细胞周期停滞等[48]。在5-FU耐药的乳腺癌(Breast Cancer,BC)细胞中，存在显著差异性表达的是：CDR1as(上调)以及miR-7(下调)，并且miR-7是CDR1as的靶基因之一，二者可共同调控周期蛋白E1(Cyclin E1,CCNE1)的表达，过表达miR-7或者沉默CDR1as都可增加5-FU耐药BC细胞的化疗敏感性，上述结论可表明CDR1as可能是确定和优化乳腺癌治疗策略的潜在工具[49]。此外，有研究者发现，与5-FU敏感大肠癌组织及细胞相比，在5-FU耐药的大肠癌中，circ-PRKDC和FOXM1的表达升高，miR-375的表达较正常组织和细胞明显下调，而沉默circ-PRKDC或过表达miR-375、FOXM1都可增加耐5-FU大肠癌细胞的敏感性，进一步的研究表明，敲除circ-PRKDC基因后可调控miR-375/FOXM1轴，抑制Wnt/β-catenin通路，增强5-FU耐药细胞对5-FU的敏感性[50]。

2.3环状RNA与铂类药物耐药 铂类药物，包括顺铂及奥沙利铂等，作为一种广谱抗肿瘤药，主要抑癌功能为：抑制DNA合成和转录，是癌症治疗最常用的药物之一[51-52]。顺铂由Michele Peyrone合成，首先是用作睾丸癌和卵巢癌的治疗药物。在对顺铂耐药和顺铂敏感的胃癌组织进行RNA测序后，得出circAKT3在顺铂耐药胃癌组织中显著表达，而与其结合的miR-198表达水平下降。功能学实验发现，circAKT3/miR-198轴靶向调控目的基因PIK3R1的表达后，激活相关信号通路PI3K/AKT，最终增加胃癌细胞对顺铂的耐药性[53]。相关研究证明，乳腺癌易感基因1(Breast Cancer Susceptibility Gene 1,BRCA1)作为DNA修复分子，可通过激活PI3K/AKT通路促进其表达，此信号通路还可增加以顺铂为基础的DNA损伤化疗药物的耐药性，表明circAKT3可作为良好生物标志物，用于预测胃癌患者是否出现顺铂耐药[54]。不同的环状RNA在同一组织或细胞中具有不同表达模式，例如，同是顺铂耐药的胃癌组织，circCUL2的含量较正常组织显著减少，而其下调可能代表着癌细胞增殖、迁移、侵袭和耐药的增强。进一步的实验表明，miR-142-3p与circCUL2、Rho相关卷曲螺旋形蛋白激酶2(Rho-associated Coiled Coil-containing Protein Kinase 2,ROCK2)的表达水平呈负相关，而circCUL2与ROCK2的表达水平呈正相关。在上调circCUL2的顺铂耐药细胞中检测到表达增加的ROCK2，这表明ROCK2可能是circCUL2通过结合miR-142-3p促进顺铂耐药胃癌细胞自噬的靶基因的表达产物[55]。此外，与顺铂敏感的肝癌组织相比，顺铂耐药的肝细胞性肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)患者组织中，circRNA-101505与含氧化硝基结构域蛋白1(Oxidored-nitro domain-containing protein 1,NOR1)表达降低，而miR-103的表达升高，且circRNA-101505是作为miR-103的“海绵”发挥作用，在过表达circRNA-101505的肝癌细胞中发现，circRNA-101505/miR-103轴可增加NOR1的表达量，从而降低肝癌细胞对顺铂的耐药性[56]。而在奥沙利铂耐药的HCC中，过表达的circFBXO11可减轻细胞周期阻滞和细胞凋亡，降低对奥沙利铂的敏感性[57]。这些结果证实了环状RNA在铂类化疗药物耐药中的重大意义，考虑到这些血清环状RNA在监测耐药性方面的敏感性和特异性，其有望成为抗癌耐药最合适的候选分子。

2.4环状RNA与索拉菲尼耐药 索拉非尼通过酶抑制作用抑制癌细胞增殖和癌周血供，主要是通过靶向B-Raf原癌基因丝氨酸/苏氨酸激酶(B-Raf proto-oncogene,serine/threonine kinase,BRAF)、C-Raf原癌基因丝苏氨酸蛋白激酶(Recombinant C-Raf Proto Oncogene Serine/Threonine Protein Kinase,Raf-1)、跨膜配体Fms样酪氨酸激酶3(FMS-like Tyrosine kinase 3,FLT3)、血管内皮生长因子-2/3(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2/3,VEGFR-2/3)和β型血小板衍生生长因子受体(Platelet-derived Growth Factor Receptor-β,PDGFR-β)等来发挥作用，特别是在调控细胞周期进程通路中发挥抗癌疗效[58-60]。而索拉菲尼作为肝细胞癌标准靶向治疗药物之一，在全球晚期肝细胞性肝癌患者的治疗中显示其巨大作用，但其和绝大多数抗癌药物一样不可避免的出现耐药反应。在对索拉非尼耐药HCC细胞系中环状RNA的表达谱进行分析，有582个环状RNA差异性表达，其中272个上调，310个表达下调。通过高通量测序探索了索拉非尼耐药HCC细胞系中差异表达的环状RNA，鉴定出三个差异表达的环状RNA，分别为hsa-circ-0006294、hsa-circ-0035944和hsa-circ-0084663，并预测它们在索拉菲尼化疗耐药中可能起重要作用[61]。

2.5环状RNA与免疫治疗耐药 目前，抗PD-1作为癌症临床免疫治疗的代表，显示出其优越的应用前景[62]。PD1是一种抑制性受体，可在活化的淋巴细胞表面表达[63]。以肝细胞为例，PD1可以在肝癌患者的NK细胞上过度表达，并促进激活的NK细胞功能失调[64-65]。在肝癌细胞中，可通过上调circUHRF1的表达，使circUHRF1/miR-449c-5p轴不再抑制TIM-3的表达，从而抑制NK细胞发挥其功能。功能性实验表明，将敲除circUHRF1的基因导入肝癌细胞后，抗PD1治疗的敏感性可增加。这些结果表明，过表达circUHRF1可能会阻碍肝癌对抗PD1治疗的反应，靶向circUHRF1可能是恢复肝癌对抗PD1治疗敏感性的一种有效方法[66]。

2.6环状RNA与内分泌治疗 苯扎鲁胺(Enzalutamide,Enz)是第二代内分泌治疗药物，它可以竞争性地与雄激素受体(Androgen Receptor,AR)结合，招募共激活剂，与AR DNA结合，激活AR靶基因[67]，但在治疗后的2～3年内，大多数患者会发展成去势抵抗型前列腺癌(Castration-resistant Prostate Cancer,CRPC)[68]。在苯扎鲁胺耐药(Enzalutamide-resistant,EnzR)的前列腺癌细胞中，检测到circUCK2和10-11转位酶1(Ten-eleven Translocation1,TET1)低表达，而miR-767-5p显著表达。此外，上调circUCK2的表达水平，则miR-767-5p表达减少，靶基因TET1表达增加，并且出现癌细胞增殖和侵袭速度减慢。由此可推断circUCK2在前列腺癌去势、EnzR以及前列腺癌的发展过程中发挥重要作用[69]。在未来的临床治疗中，可通过检测TET1的表达明确前列腺癌的进展，使用TET1激动剂或上调TET1的表达来辅助治疗。他莫昔芬(Tamoxifen，TAM)是一种选择性雌激素受体调节剂，广泛用于乳腺癌的治疗，然而接受TAM治疗的患者中有30 %～40 %在15年内复发，成为典型的TAM耐药肿瘤[70-71]。在构建的他莫昔芬耐药乳腺癌细胞中，通过高通量测序技术检测出，hsa-circ-0025202在癌组织中低表达，hsa-circ-0025202过表达可通过miR-1825P/FOXO3a轴实现抑瘤和他莫昔芬增敏作用[72]。hsa-circ-0025202可能是TAM耐药的一个重要的、有前景的生物标志物，这需要进一步的临床研究来证明。

综上所述，耐药已成为肿瘤治疗中不可避免的一个问题，探索癌症化疗耐药的机制将为改进肿瘤治疗提供机会。已经证实，环状RNA失调与肿瘤进展和化疗耐药密切相关。环状RNA可在体液中大量表达，并可能以细胞和组织特异性的方式表达，它们还通过不同的生物学功能在肿瘤耐药中发挥重要的作用。环状RNA所特有的闭环结构为其在体液和血液中的稳定性存在提供了有利条件。液体活检是一种微创的分析患者液体标本的方法，已广泛应用于肿瘤检测[73-74]。因此是否可将环状RNA作为生物标志物纳入临床检验诊断，也是我们目前尚需考虑的一个方向。

3 前景及展望

越来越多的环状RNA被证实与肿瘤药物治疗耐药相关。因此，将环状RNA纳入临床诊断治疗，我们有两方面需考虑。首先，其作为竞争性RNA分子，可调节miRNA的表达，能够作为临床治疗的直接靶点[75]。一些主要致癌环状RNA在不少肿瘤中的表达都存在异常，并与多药耐药相关。对这些致癌环状RNA的精确调控可能会在恶性肿瘤的治疗中起作用。环状RNA特有的反向剪接结构代表了其可作为潜在的治疗靶点，让我们能够更精确地调控这些致癌环状RNA，且不会影响正常线性RNA的功能。其次，由于一些环状RNA与miRNA结合位点数较多，其可作为肿瘤抑制因子成为潜在的治疗靶点，circRNA-101505通过海绵化miR-103减轻肝癌对顺铂的耐药性就是一个典型的例子[56]。事实上，环状RNA的海绵作用可被用来特异性地设计和靶向致癌miRNA谱，从而发挥肿瘤治疗作用。然而，实施上述任何一种策略，都将面临一个主要挑战，即如何准确、安全地将环状RNA转运到恶性肿瘤细胞中，并且不对正常细胞产生影响。制备环状RNA模拟物或拮抗剂，并使其在体内保持稳定性、生物活性以及增加靶向递送效率是成功开发基于环状RNA疗法的关键因素。