微小RNA、长链非编码RNA及二者相互作用调控成骨细胞功能的研究进展

王艺璇，王 可，张 舒

空军军医大学 航空航天生物动力学教研室，航空航天医学教育部重点实验室，陕西西安 710032

成骨细胞起源于间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，是新骨形成的关键细胞，对骨骼的生长和维持至关重要。成骨细胞在许多骨疾病，特别是在骨质疏松症、骨发育不良和原发性骨肿瘤的发病机制中起着至关重要的作用[1]。在骨组织中，骨形成取决于成熟成骨细胞的数量和功能，与成骨细胞的形成、寿命和活性密切相关。而成骨细胞的数量和活性均由细胞转录和表观遗传机制控制，并受到激素、机械应力和细胞间相互作用等方式调节[2-4]。

人类基因组中只有1% ～ 2%的基因可编码蛋白质，其余98%曾被认为是“垃圾”DNA，然而越来越多的特异性非编码RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)被认为是某些生物学过程的关键性调控因子，包括调控基因表达、细胞周期、染色质重塑和表观遗传修饰等[5]。ncRNAs中有一部分是管家ncRNA(house-keeping non-coding RNA)，包 括核糖体RNA、转运RNA、胞质小RNA和核内小RNA等，这些RNA分子直接或间接参与蛋白质的表达。大部分ncRNA则是在一定条件下诱导表达，可以调节蛋白质编码基因的表达，因而被称为调节性ncRNA(regulatory non-coding RNA)，依据分子大小可分为短链非编码RNA和长链非编码RNA[5]。短链非编码RNA分子小于50 nt，主要分为微小RNA(microRNAs，miRNAs)、内源性小干扰RNAs(endo-siRNAs)和PIWI相互作用RNAs(piRNAs)。长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)则主要指分子大于200 nt的调节性非编码RNA。microRNAs和lncRNAs在成骨细胞蛋白质基因表达中发挥着重要的调节作用，其相关研究较多也较为深入，本文就近年来microRNAs、lncRNAs及其相互作用调控成骨细胞功能的研究进 行综述。

1 microRNAs调控成骨细胞功能

microRNAs是长度为22 nt左右(18 ～ 25 nt)的内源性非编码RNA，可通过与特定信使RNA 3’UTR区结合形成miRNA诱导的沉默复合物，负向调控基因表达，从而诱导其降解或抑制其翻译[6]。哺乳动物miRNAs的合成受到精细的调控，一般来说是在RNA聚合酶Ⅱ催化作用下转录产生miRNA的初级前体(pri-miRNAs)，经RNAseⅢ酶Drosha和pri-miRNA结合蛋白DGCR8组成的微处理器加工为具有发卡结构的前体miRNAs(premiRNAs)，然后通过输出蛋白(exportin 5)转运到细胞质中。在细胞质中，pre-miRNAs被Dicer切割为成熟的RNA双链，与AGO蛋白结合，将特定的miRNA链整合到RNA诱导沉默复合物中，进 而靶向调节靶基因mRNA表达[7]。

1.1 microRNAs在成骨分化过程中的改变 成骨细胞的分化过程以成骨细胞特异基因的顺序激活为标志，经过细胞增殖、细胞外基质沉积、成熟和矿化后，一部分走向凋亡，另一部分则被周围矿化基质包埋形成骨细胞。在成骨细胞分化过程中，众多miRNAs的表达会发生改变。Oskowitz等[8]研究发现如果抑制人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hMSCs)中miRNAs的合成，其成骨分化能力减弱，并发现hMSCs向成骨细胞分化过程中有19个miRNAs表达上调。Gong等[9]通过Satb2诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化，发现了miR-27a等10个下调的miRNAs及miR-17等18个上调的miRNAs，生物信息学分析显示这些miRNAs的靶基因参与了多条成骨分化通路，与骨形成及骨骼发育密切相关。而通过BMP2诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的过程中有22个miRNAs表达发生了显著变化，且其中具有代表性的miR-133和miR-1 35均可促进骨形成[10]。

1.2 microRNAs调控成骨细胞分化 成骨细胞分化过程中，miRNAs表达发生改变，且在成骨细胞分化基因转录后调控中发挥着关键作用。Runx2是成骨细胞分化的主开关，可以调节成骨细胞中ColⅠ、ALP和骨桥素等多个分化相关基因的表达，miR-433、miR-103a、miR-628-3p、miR-155、miR-204、miR-205-5p、miR-505和miR-30家族等可以降低间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)及成骨细胞中Runx2的表达并抑制成骨分化[11-18]。成骨细胞分化过程还受到骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信号的调节，miR-542-3p、miR-98可分别靶向抑制BMP-7及BMP-2[19-20]，miR-222-3p、miR-155、miR-106b-5p和miR-17-5p则可通过特异性阻碍Smad5的翻译中断BMP信号通路，从而导致成骨抑制[21-23]。同时部分miRNAs可通过靶向成骨分化过程中的一些关键基因抑制成骨细胞分化，如miR-637靶向Osterix[24]、miR-186靶向SIRT6[25]、miR-143靶向k-RAS[26]、miR-3 077-5p和miR-705靶向HOXA10[27]，miR-214抑制ATF4和成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1，FGFR1)[28-29]。另有研究表明，miRNAs不仅可以通过靶向成骨因子抑制成骨细胞分化，还可通过靶向成骨抑制因子促进成骨细胞分化。组蛋白脱乙酰酶(histone deacetylase，HDAC)是一种特殊的蛋白质，能够负向调控Runx2等基因的表达，并可受到miRNAs调控[30]。miR-449a可抑制成骨细胞HDAC1的表达，维持组蛋白乙酰化状态，刺激Runx2基因表达[31]。miR-233可抑制小鼠MC3T3-E1前成骨细胞中的HDAC-2表达，miR-873-3p可抑制大鼠成骨细胞UMR106-01中HDAC4的表达，进而促进成骨细胞分化[32-33]。miR-143则可通过抑制HDAC7促进成骨细胞分化，且可以促进内皮细胞血管生成，小鼠体内过表达miR-143可有效改善骨质丢失及老年性骨质疏松[34]。BMP途径的下游调节因子Smad 1、Smad 5、Smad 6和Smad 7可结合Smad泛素调节因子1(Smad ubiquitination regulatory factor-1，Smurf-1)诱导E3泛素连接酶依赖性蛋白降解[35]。miR-590-5p通过靶向Smad7，miR-503、miR-15b和miR-17则通过靶向Smurf-1，间接保护Runx2降解减少而促进成骨细胞分化[36-39]。Hsc70相互作用蛋白/STIP1同源性的C末端和含有蛋白1的U-Box(CHIP/STUB1)可通过促进Runx2蛋白降解而负调控成骨细胞分化，miR-764-5p则可抑制CHIP蛋白翻译而促进成骨分化[40]。He等[41]研究发现，miR-20b可通过抑制PPARγ、Bambi和Crim1在多个阶段激活BMPs/Runx2信号通路而促进成骨。miR-335-5p则可通过下调Dickkopf相关蛋白1上调β-catenin表达，激活Wnt信号通路，促进成骨分化[42]。另有一项研究表明，miR-29b对成骨分化具有正性调控作用，可直接下调已知的成骨细胞分化抑制因子HDAC4、TGF-β3和ACVR2A等，并可抑制胶原合 成，促进骨质矿化[43]。

1.3 microRNAs调 控 成 骨 细 胞 增 殖 和 凋 亡 miRNAs同时也能调控成骨细胞的增殖和凋亡[44]。研究发现，miR-17-92基因簇可促进成骨细胞增殖，抑制其凋亡[45-46]。microRNA-23a则可通过调节Fas的表达，抑制小鼠成骨细胞凋亡[47]。相反，miR-182可通过抑制FoxO1减少成骨细胞增殖，促进其凋亡[48]。Wei等[49]研究发现，miR-34b/c基因敲除小鼠模型中成骨细胞数量增加，细胞实验进一步证实miR-34b/c通过抑制细胞周期蛋白D1积累来抑制成骨细胞的增殖。miR-542-3p的过表达则可通过抑制BMP-7及其下游PI3K/survivin通 路促进成骨细胞凋亡[19]。

2 lncRNAs调控成骨细胞功能

lncRNAs是长度超过200 nt的非编码RNA，大多数由RNA聚合酶Ⅱ转录产生，具有mRNA的结构特征(5’帽式结构和3 ’polyA尾)，但没有长阅读框架。lncRNAs可以定位于胞核和胞质中，通过多种机制调节基因表达。定位于细胞核的lncRNAs，主要参与蛋白质编码基因表达的转录调控和表观遗传调控等；而定位于细胞质的lncRNAs，则主要参与转录后基因调控过程，尤其是 与microRNAs相互调控[5]。

2.1 lncRNAs在成骨分化过程中的改变 通过高通量技术检测发现，lncRNAs在成骨分化过程中表达发生改变。Zuo等[50]研究发现，骨髓间充质干细胞C3H10T1/2诱导分化过程中有116个差异表达的lncRNAs，并发现了24对lncRNAs和附近的mRNAs协同差异表达。Qiu等[51]在hBMSCs的成骨分化中发现433个持续上调和232个持续下调的lncRNAs。Song等[52]在MSC成骨分化过程中发现574个lncRNAs的表达发生显著改变，其中TCONS_00046478、TCONS_00027225和TCONS_00007697可能作为miR-689、miR-544和miR-640的前体调控共表达基因(Col4A4、Col21A1和WNT2)在成骨分化中发挥作用。Wang等[53]在hBMSCs成骨分化过程中的lncRNAs微阵列分析鉴定出1 206个差异表达的lncRNAs，其中H19和uc022axw.1可能在成骨过程中起重要作用。Zhang等[54]认为MSC成骨分化过程中1 408个差异表达明显的lncRNAs中有6个核心调控因子(NR_024031、XR_111050、FR148647、FR406817、FR401275和FR374455)，且XR_111050具有促进成骨细胞分化的潜能。Xie等[55]研究发现强直性脊柱炎患者骨髓MSC较正常人MSC具有更强的成骨分化能力，微阵列分析结果显示有520个差异表达明显的lncRNAs，其中lnc-ZNF354A-1、lnc-LIN54-1、lnc-FRG2C-3和lnc-USP50-2可能参与了强直性脊柱炎患者骨髓MSC的成骨分化异常。在其他类型的细胞中，如人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)、人脂肪干细胞(human adipose-derived stem cells，hASCs)和小鼠成骨细胞系MC3T3-E1中，同样发现 成骨分化过程中lncRNAs表达的显著差异[56-59]。

2.2 lncRNAs调控成骨细胞分化 在成骨细胞中，目前研究较多的是lncRNAs对成骨分化的调控作用[60-61]。在转录水平，Tang等[62]研究发现，BMSCs中lncRNA OG可与异质核核糖核蛋白K蛋白相互作用激活BMP信号通路促进成骨分化。Jin等[63]发现在hASCs中lncRNA MIR31HG可以直接与IκBα相互作用，参与NF-κB的活化。敲除MIR31HG基因不仅能显著促进成骨分化，还能显著缓解炎症诱导的hASCs成骨抑制作用。在老龄化研究中发现lncRNA Bmncr可以调节BMSCs的命运。Bmncr作为促进TAZ和ABL蛋白相互作用的支架，可以促进TAZ和Runx2/pPARG转录复合物的组装，进而促进成骨分化并抑制脂肪生成[64]。而在成骨相关疾病的研究中同样发现，多发性骨髓瘤患者的hBMSCs成骨分化受到抑制，lncRNA MEG3表达降低。MEG3通过直接影响SOX2活性而激活BMP4的转录活性，基因敲除MEG3可显著降低成骨标志物Runx2等的表达[65]。lncRNAs也可以在表观遗传水平调控成骨分化，尤其是通过组蛋白修饰影响基因表达。EZH2可以通过催化靶基因启动子组蛋白H3K27的甲基化抑制靶基因的表达。lncRNA HoxA-AS3和lncRNA ANCR均可与EZH2结合引起H3K27甲基化，抑制MSCs中Runx2的表达，进而抑制成骨分化[66-67]。另有研究发现，lncRNAs可以通过组蛋白乙酰化修饰靶基因，如lncRNA AK141205和lncRNA-HIF1α-AS1可以分别通过促进CXCL13、HoxD10启动子区组蛋白H4的乙酰化上调其表达，进而促进成骨细胞分化[68-69]。而在转录后水平，尤其是lncRNAs和microRNAs相互调控进而影响成骨细胞功能的研究目前较多也较为成熟，下 文将进行重点阐述。

2.3 lncRNAs调控成骨增殖和凋亡 lncRNAs同样可以调节成骨细胞的增殖和凋亡。lncRNA DANCR在hBMSCs中的表达减少，可通过p38丝裂原活化蛋白激酶途径抑制成骨细胞增殖[70]。在hPDLSCs中抑制lncRNA ANCR表达，可抑制GSK3β表达，激活Wnt通路促进其增殖[71]。在MC3T3-E1细胞中，lncRNA Crnde也可以通过Wnt通路促进成骨细胞增殖[72]。而去卵巢骨质疏大鼠成骨细胞中lncRNA AK023948表达明显增多，通过调节AKT磷酸化水平抑制成骨细胞增殖[73]。此外，重力敏感的lncRNA ODSM在MC3T3-E1细胞 中不仅能促进成骨分化，也能抑制其凋亡[74]。

3 microRNAs和lncRNAs相互作用调控成骨细胞功能

竞争性内源性RNAs (competitive endogenous RNAs，ceRNAs)假说是一种重要的功能模式，lncRNAs可通过与miRNAs相互作用作为ceRNA调节基因表达，这类lncRNAs亦被称为miRNA海绵[75]。这类lncRNAs包含一个或多个miRNA的结合位点，并通过吸附miRNAs减少其与靶mRNA的结合或加速其降解。反过来，miRNAs也可以与lncRNAs通过AGO2途径结合调节1ncRNAs的表达水平。

目前研究发现microRNAs和lncRNAs可以相互作用，协同调节成骨细胞功能。研究发现，lncRNA PGC1β-OT1可以通过拮抗miR-148a-3p促进赖氨酸特异性脱甲基酶6b(KDM6B)的表达，MCF2L-AS1也可通过结合miR-33a促进Runx2表达，LOC100506178和lncRNA Rhno1可分别与miR-214-5p和miR-6 979-5p结合促进BMP2表达，进而促进BMSCs向成骨细胞分化[76-79]。Linc-ROR同样可以通过结合miR-138和miR-145，促进ZEB2的表达，进而激活Wnt/β-catein通路，促进成骨细胞分化[80]。牙周炎患者hPDLSCs中lncRNA-POIR表达下降，与miR-182相互抑制，形成一个网络来调节FoxO1表达，促进hPDLSCs向成骨分化[81]。在hASCs的研究中发现lncRNA-HIF1A-AS2、lncRNA-PCAT1可分别吸附miR-665和miR-45-5p，促进ASC成骨分化[82-83]。Linc02349作为miR-25-3p和miR-33b-5p的分子海绵可分别调控SMAD5和Wnt10b的表达，激活Dlx5/OSX途径，从而促进人脐带源性干细胞向成骨分化[84]。在MC3T3-E1细胞中发现lncRNA OGRU可通过竞争性结合miR-320促进Hoxa10蛋白表达，进而促进成骨细胞分化[85]。相反的，Yang等[86]在骨质疏松患者的骨组织中及去卵巢骨质疏松小鼠的BMSC和骨组织中观察到lncRNA-ORLNC1表达升高。进一步研究发现lncRNA-ORLNC1可以作为ceRNA结合miR-296，影响靶基因Pten的表达，抑制成骨分化。骨质疏松患者血清中lncRNA H19表达显著减少，体外研究发现lncRNA H19可以通过下调miR-19b-3p表达而显著抑制BMSCs细胞增殖和成骨分化[87]。在小鼠MC3T3-E1前成骨细胞中，miR-139-3p可以抑制成骨细胞分化、促进成骨细胞凋亡，并且可以与lncRNA ODSM相互调控[88]。而lncRNA KCNQ1OT1可以与miR-701-3p相互作用，通过调控FGFR3表达促进MC3T3-E1细胞增殖、迁移，减少凋亡[89]。Bu等[90]发现lncRNA TSIX可以负性调节miR-30a-5p表达，促进成骨细胞凋亡。此外，He等[91]研究发现miR-141可以通过下调lncRNA H19和miR-675的表达，抑制成骨细胞增殖，促进成骨细胞凋亡。

lncRNAs还可作为具有miRNAs的前体分子发挥调控功能。Huang等[92]研究发现，lncRNA H19外显子可以编码miR-675，抑制TGF-β1的mRNA和蛋白表达，减少Smad3的磷酸化水平，进而通过下调组蛋白去乙酰化酶4/5的表达，增加成 骨标志基因Runx2等的表达，促进成骨分化。

4 结语

综上所述，microRNAs和lncRNAs在成骨细胞中构成了复杂的相互作用网络，可以调控成骨细胞功能，影响骨形成，对骨稳态的维持至关重要。然而目前仍有一些问题需要解决，如成骨细胞中不同microRNAs和lncRNAs相互作用的研究较少，成骨细胞众多发挥作用的ncRNA中最为关键的分子尚不十分明确。进一步研究应阐明成骨细胞中microRNAs和lncRNAs的作用机制，探寻其关键通路和靶点，可以更好地帮助研究骨质疏松、骨发育不良等疾病的发病机制，并可能为这些疾病提供新的治疗药物。