全基因组测序技术在结核病病原学诊断和监测中应用的研究进展▲

2021-03-26 10:42林定文崔哲哲

广西医学 2021年7期

林定文崔哲哲

(广西壮族自治区疾病预防控制中心营养与学校卫生所，南宁市 530028，电子邮箱：drldw@163.com)

【提要】中国政府在《遏制结核病行动计划(2019-2022年)》中提出，各地要提高结核病实验室诊断能力，缩短诊断时间，病原学阳性的肺结核患者耐药筛查率应达90%以上，最大限度发现耐药结核病患者。但目前传统的检测方法不但耗时长，而且精确度有限。微生物全基因组测序技术是近年来兴起的结核分枝杆菌菌种鉴定、耐药检测和公共卫生监测手段。本文对近年来全基因组测序在结核病病原学诊断和监测领域中的研究进展进行综述，以评估其在国内的应用价值和前景。

结核病是一种由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的慢性传染病[1]。目前，结核病疫情形势依然严峻，2018年全球约有1 000万例新发结核病，结核病死亡人数约150万(其中包括25.1万HIV阳性患者)[2]。我国是全球结核病高负担国家之一，结核病疫情呈高患病率、高耐药率、高死亡率、高感染率等特点[3]。为此，中国政府在《遏制结核病行动计划(2019-2022年)》[4](下称《行动计划》)中明确了履行“终止结核”国际承诺的行动目标。《行动计划》提出，各地要提高结核病实验室诊断能力，缩短诊断时间；病原学阳性的肺结核患者耐药筛查率应达90%以上，最大限度发现耐药结核病患者。为实现上述目标，中国政府要求相关部门开展集诊断、治疗和预防于一体的综合干预措施，并总结出可复制可推广的防控新模式和新策略的行动纲领。同时，应加快结核病诊疗管理的信息化建设，逐步提高医疗机构、疾控机构和基层医疗卫生机构患者诊疗服务的精准性、时效性以及各机构之间信息的互联互通[4]。现就目前全基因测序(whole-genome sequencing，WGS)技术在结核病病原学诊断和监测中的应用研究进展进行综述。

1 分枝杆菌的复合群分类

分枝杆菌种类繁多，按菌群可分为MTB复合群、麻风分枝杆菌、非结核分枝杆菌(Nontuberculosismycobacteria，NTM)[5]。MTB简称为结核杆菌，早在1882年，德国细菌学家柯赫就已证实MTB是导致结核病的病原菌[1]。NTM是分枝杆菌属内除MTB复合群和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌[6]。迄今为止，共发现约160种NTM，大部分营腐生或营寄生，少部分对人体致病。NTM可侵犯肺脏、淋巴结、骨骼、皮肤和关节等组织器官[7]。近年来，NTM感染的发病率呈快速升高趋势[8]。在我国浙江、福建、广东等沿海省份的部分地区，因NTM导致的结核病患者占全部结核病患者的10%～25%[9]。由于分枝杆菌各菌种的生物学特性、致病性、耐药性等特点不尽相同，对菌种进行鉴定对于分枝杆菌及其所致疾病的基础研究、预防和治疗具有十分重要的意义。

2 传统菌种鉴定和监测技术瓶颈

准确及时地鉴定分枝杆菌、获取药敏信息，对有效地控制传染源、预防结核病至关重要[2]。通常MTB及其耐药性检测依赖于生物安全三级实验室中液体或固体培养基的培养。传统的L-J固体培养方法简单、经济，易于推广，但是培养周期长(8～12周)[10-11]。BACTEC MGIT 960是美国BD公司在不断完善BACTEC MGIT 460TB技术的基础上建立的新一代液体培养荧光检测系统[12]，其阳性检出率和培养时间均较涂片和L-J培养基具有明显的优势，可缩短报告时间，应用价值获得全球广泛认可[13]。目前，国内的结核病临床实验室大多采用对硝基苯甲酸和噻吩二羧酸肼培养基生长试验，对分枝杆菌培养阳性的菌株进行鉴定。其中，在硝基苯甲酸和噻吩二羧酸肼两种培养基上均生长的细菌为疑似NTM；只在其中一种培养基上生长或者在两种培养基上均不生长的细菌则认为是MTB复合群[5]。对于疑似NTM，可以使用16S rRNA基因扩增测序后全局比对标准DNA序列的方式进行菌种判定，一般认为序列一致性达到97%以上为同种细菌[14]。根据序列比对的结果，培养基长生试验筛选得到的疑似NTM仍有一小部分可能是MTB，也可能是诺卡氏菌。由于分子诊断得到的结果比培养基长生试验更可靠，目前已有部分医疗机构使用基因芯片或分子探针进行NTM的诊断，其检测的分子靶标覆盖16S rRNA、hsp65等基因，但目前的研究结果提示单个基因(如16S rRNA基因)的分辨率只能鉴定到同属，而无法完全鉴定到同种[15]。而无论是菌种鉴定还是药敏试验，这些传统技术均具有简单、经济等优势，但耗时较久，操作复杂且结果不稳定，可重复性差，远不能满足快速准确检测的需要[16]。

在病原监测方面，结核病是我国法定报告的乙类传染病。由于目前所使用的技术手段和报告方式具有局限性，肺结核聚集性疫情的发现大多依赖于回顾性的流行病学研究。对于疾控部门而言，疫情暴发的早期识别和预警，乃至早期的干预控制，依然是结核病防控的难题。这种困难体现为：由于分辨率低，病原分型信息无法支持决策，同时也无法在建立诊断的第一时间获得；现场流行病学信息往往缺失或者失真，而公共卫生事件的预警不足和处置不当会导致其演变为公共卫生危机事件，影响社会稳定。在临床诊断方面，正如《行动计划》提出的2022年定点医院能力建设目标，目前我国的基层(市级和以下)定点医院依然缺乏必要的病原学诊断能力，上述现有的实验室技术经多年的推广后仍不具有足够的可及性。按目前制度要求和人员、设备的现状，县级结核病定点医院开展痰涂片、痰培养时，阳性标本或培养物需送市级相关机构开展菌种鉴定和药敏培养，这导致实验结果报告所需时间长，患者常得不到及时、精准的治疗，同时较长的结果等待期也使患者的耐心耗尽，甚至失访。此外，在标本上送运输的过程中，标本的活性和生物安全存往往也得不到保障。因此，目前传统菌种的鉴定和监测依然困难重重，尚不能利用现有传统技术手段及时、准确地诊断和防治结核病。

3 WGS技术在结核病病原学诊断和监测中的应用

随着微生物基因组流行病学的兴起和高通量测序技术的发展，上述传统手段无法解决的问题有望得到解决。WGS技术的优势在其是目前分辨率最高的分子分型和鉴定技术，并且可以一次性考察所有关注的病原信息点，包括病原的物种、亚型以及毒力基因、抗生素抗性等特性，且实验数据容易标准化以进行室间评价、历史数据比较等。

微生物基因组学技术应用于结核病病原学的诊断和监控，一方面能满足结核病全面、快速、可靠的病原学诊断的需要；另一方面其高分辨率的优势能满足结核病流行病学的调查与控制[17-18]。将结核病的诊断与控制工作合二为一(诊防一体)，充分利用有限的资源，有利于实现控制结核病疫情的目标。随着WGS技术的成熟，一些公共卫生机构，如美国疾病预防控制中心和食品药品监督管理局，已经在尝试使用全基因组序列比对——DNA-DNA杂交的数字化模拟手段作为细菌鉴定的“金标准”。2013年，Köser等[19]使用WGS技术成功将结核杆菌的检验时间从几周缩短到几天，这表明WGS应用于结核病病原菌的诊断具有很高的可行性。2015年7月，Brown等[20]首次在未培养的痰液样本中成功进行MTB基因组测序，但由于操作复杂并且成本较高，目前难以满足实际应用的需求。

我国专家在最近发表的专家共识中，明确了结核病聚集性疫情调查时WGS技术在病原学分子分型中的应用价值[21]。同时，随着测序价格的持续降低，WGS技术的费用已经可以被发展中国家的一线检验或流行病监控工作所接受。但也有专家认为，在WGS技术广泛应用之前，仍需要大量的标准化和验证性的工作，尤其是在高负担的发展中国家[22]。

4 WGS技术在耐药检测领域中的应用

美国疾病预防与控制中心指出，快速灵敏的MTB培养和药敏试验是控制结核病的首要条件[18]。利福平是治疗结核病最有效的药物之一，然而根据世界卫生组织的报告，2018年新发结核病患者中约有48.4万例利福平耐药患者，其中78%为多重耐药结核病，耐药结核病已成为全球结核病治疗和预防所面临的最大威胁之一[2]。MTB的耐药问题已成为全球关注的热点问题[23-25]，也是我国结核病防治工作中面临的挑战之一，广泛耐药结核病的成功诊断和治疗取决于是否获得全面、准确的药物敏感性试验结果。但药敏检测结果需要数周甚至数月的时间才获得，并且许多地区缺乏所需的实验室条件和资源，即使在资源充足的国家，传统的方法完成所有检测通常也需要1～2个月，药敏周期长也可能导致药敏结果出现偏差[26-27]。此外，培养法药敏表型检测的准确性和重复性通常较差，特别是对于吡嗪酰胺等药物[28]。因此，临床实验室亟须引入快速的分枝杆菌药敏试验方法。

随着MTB耐药分子机制逐渐被阐明，通过检测耐药基因突变来快速诊断耐药结核病日益受到重视[29-31]，分子检测的使用频次不断增加。我国于2017年将分子诊断技术纳入了肺结核的诊断标准之一，大幅提高了结核病病原识别和耐药监测的效率[32]，目前已经有商品化的Gepheid Gene Xpert MTB/利福平以及Hain GenoType MTBDRplusand MTBDRsl被证明可以缩短结核病患者诊断并开始治疗的时间[33]。虽然这些技术可以使越来越多的耐药结核病患者被尽早发现和治疗，但仍存在重要的诊断缺口。2018年经细菌学确诊的结核病患者接受利福平耐药性检测的比例为51%，而2018年接受治疗的耐多药及仅利福平耐药患者(156 071例)仅占罹患耐多药及仅利福平耐药(约50万)患者的1/3[3]。已有的分子检测技术能快速鉴定耐药菌株或进行部分药敏检测，但只能检测微一小部分的生物基因组，不能满足全部的检测需求[26-27,33]。因此，迫切需要能提供结核病菌株全面耐药信息的快速诊断技术，以弥补现有技术的不足。

其他分子检测技术通过探针或特定基因序列杂交的方法可以间接鉴定MTB或检测有限的耐药突变信息，而WGS技术可以检测全部基因序列信息，包括其他分子检测技术可能无法识别的插入、缺失或者罕见突变等序列层面的信息，例如异质性耐药或者混合感染[34]，并且可多次检测每个DNA碱基。因此WGS技术为耐药结核病的检测提供了一个强有力的选择，其可以提供更准确的深度基因多态性检测，目前已经有多种WGS平台可以用于耐药结核病的诊断。

耐药结核病的流行病学监控、公共卫生干预和控制依赖于全面、快速、准确的检测，包括MTB复合物鉴定、药敏检测和细菌基因分型。WGS技术能提供更全面的结果，在一次试验中完成菌种鉴定、药敏检测和基因分型，但受限于结核杆菌样本的核酸总量，需要对原始样本进行一定的培养[27,35-36]。Coll等[37]的研究显示，与使用商品化的分子探针法相比，使用WGS技术对结核病的病原体进行耐药检测具有相似或更高的敏感度，这表示WGS技术有取代目前广泛应用的分子探针法的可能。同时，Coll等[38]也成功将高分辨率的WGS技术应用于MTB的分子分型上。2018年，德国结核参比实验室评估了Cepheid GeneXpert MTB/利福平、线性探针检测(Hain GenoType MTBDRplus2.0 and MTBDRsl2.0)及WGS 3种分子药敏检测技术对多耐药、广泛耐药结核病治疗效果的影响，结果显示，WGS技术可用于判断复杂的耐药，与基于药敏表型检测结果建立的治疗方案相比，WGS技术的处方一致性最高，有利于为患者提供更合适的治疗方案[39]。

一项横跨6大洲16个国家、10 209个菌株的研究显示[40]：利用WGS技术能够准确判断抗结核药物的敏感性，WGS技术的敏感性、特异性可以满足临床应用需要；同时，WGS技术能像药敏表型检测法一样提示不应使用哪种药物而应该使用哪种药物治疗。在日常使用WGS技术进行结核菌诊断时，还能降低培养法和表型分析等的工作量[40]。英国、荷兰以及美国的公共卫生当局已经决定，当WGS检测显示受试菌株对一线抗结核药物敏感时，将不再使用药敏表型检测法进行分析，这一系统性的改变节省了大量的费用和时间[40]。为指导新的基因组学技术的实施应用，世界卫生组织在2018年发布了WGS技术用于MTB耐药检测的技术指南，该指南总结了WGS技术的特点以及相关技术的发展现状，以指导中等收入和低收入国家建设WGS平台体系，从而用于诊断结核病的耐药性[40]。WGS技术以其显著的优势，逐渐改变结核病尤其是耐药结核病的诊断流程。随着WGS技术在临床中的广泛应用，药敏表型检测的应用将会减少，尤其是药敏表型法检测结果不可靠的药物，例如吡嗪酰胺。另外，在没有药敏表型法检测能力的地区，同样可以使用WGS进行全面、快速、低成本的检测[41]。

5 小结