干性ARMD中视网膜色素上皮细胞的作用及损伤机制

孟佳敏，李 健，张红兵

0引言

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，ARMD)是发生在视网膜黄斑区的一种慢性退行性疾病，是造成老年人视力丧失的主要原因[1]。ARMD是一种多因素致盲眼病，临床上将其分为湿性和干性。湿性主要表现为黄斑区视网膜色素上皮层下或上有活跃的新生血管，而干性主要表现为黄斑区神经组织萎缩[2-3]。目前对湿性ARMD的治疗已取得较大进展，但对干性ARMD的治疗方法和效果十分有限，且干性ARMD占该病约90%[4]。因此本文重点总结干性ARMD的发病机制。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)是位于光感受器和Bruch膜-脉络膜复合体之间富含色素的单层上皮细胞，其主要功能是吞噬视细胞脱落的膜盘等代谢产物以保护视网膜免受光线和自由基损伤，同时分泌多种生长因子和免疫抑制因子，发挥血-视网膜屏障作用，对维持视网膜视锥细胞和视杆细胞正常微环境发挥重要作用[5-6]。RPE功能异常将导致视锥细胞和视杆细胞的营养物质供给发生困难，脱落的膜盘等代谢产物堆积，最终使视细胞凋亡、视功能障碍。大量研究表明，RPE功能异常是干性ARMD发生的首要因素[7]。本文就近年来RPE损伤导致干性ARMD发生的作用机制进行综述，总结了蓝光、吸烟、氧化应激、脂褐素积累、慢性炎症和蛋白质稳态对干性ARMD的作用和可能机制，为进一步了解ARMD的发病机制提供新的帮助。

1蓝光

人眼不同组织的屈光介质在光波长小于300nm时对光的渗透作用不同，当波长介于300～400nm之间时可穿透角膜并被虹膜吸收，而介于415～455nm之间的波长可以穿透晶状体进入视网膜，对视网膜造成光化学损伤。黄斑区视锥细胞能够吸收的最大光谱是440nm，因此，当视网膜暴露于400nm左右的近蓝光下时，容易对视网膜造成较严重的损伤。研究发现，RPE细胞受到不同波长、不同时间的蓝光照射后，细胞增殖受到抑制、细胞死亡率增加，且波长越短对细胞损害作用越大[8]。国内外均有研究表明，蓝光损伤是造成ARMD发生的重要原因。

蓝光对RPE细胞的损伤主要表现在：(1)RPE细胞受到不同时间蓝光照射后，细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量明显增加，且其生成量与光照时间呈正相关，同时随光照时间增加，细胞内凋亡蛋白Caspase-3、Bax表达增多，抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少，细胞发生凋亡[9]。(2)蓝光导致RPE细胞线粒体DNA发生损伤。研究发现，蓝光照射RPE细胞超过2h后，细胞内线粒体DNA拷贝数出现明显下降、突变率增加，进而激活线粒体凋亡途径，RPE细胞发生损伤[10]。(3)蓝光对含有N-视黄基-N-视黄乙醇胺(N-retinyl-N-retinyli-dene ethanol-amine，A2E)的RPE细胞产生毒性作用。Marie等[11]模拟视网膜上的生理光条件，将载有A2E的RPE细胞暴露于10nm宽光谱的特制LED纤维光装置中15h后，发现在415～455nm的蓝紫色光光谱波段，RPE细胞产生过高水平的过氧化氢和超氧阴离子，同时细胞核周聚集线粒体，线粒体膜电位和呼吸活动均降低，对细胞产生毒性作用。(4)通过G蛋白偶联的cAMP-PKA信号通路对RPE细胞产生损伤。cAMP-PKA信号通路在调节细胞增殖与分化过程中发挥重要作用，已有研究发现，该信号通路在RPE细胞凋亡过程中起介导作用。杨薇粒等[12]用不同时间蓝光照射体外培养的RPE细胞，发现细胞内cAMP和PKA浓度均随光暴露时间延长显著下降，cAMP-PKA信号通路进行性下调，诱导RPE细胞发生凋亡。(5)通过增加细胞内Ca2+浓度对RPE细胞造成损伤。Ca2+在调控细胞分化、增殖、自噬和凋亡等过程发挥重要作用，其浓度变化将影响细胞各项生理活动，在高糖、缺氧和某些药物等刺激因素存在时，细胞内钙离子浓度增加，引起钙超载，从而促进细胞凋亡。Ca2+主要通过L型电压依赖性钙离子通道进入RPE细胞。研究[13]发现，RPE细胞受到一定时间的蓝光照射后，细胞内L型电压依赖性钙离子通道功能和L型电压依赖性钙离子通道核心蛋白Cav1.2表达增加，导致细胞内游离的Ca2+浓度增加，引起RPE细胞发生损伤。(6)通过上调miRNA表达，抑制RPE细胞增殖。朱红娜等[14]用一定波长的蓝光照射RPE细胞后，发现细胞增殖能力减弱，细胞内miR-103含量较对照组增加，而下调miR-103表达后，RPE细胞增殖能力有所恢复，表明蓝光通过上调miRNA抑制RPE细胞的增殖。

2吸烟

吸烟是干性ARMD发生的主要危险因素之一。研究[15-16]显示，与不吸烟者相比，吸烟者发生干性ARMD的相对危险度为2.54。Espinosa-Heidmann等[17]发现，暴露于香烟烟雾或与吸烟有关的强氧化剂对苯二酚的动物模型中，RPE细胞下形成沉积物，Bruch膜增厚，这些变化与早期ARMD中RPE细胞凋亡的特征性病理改变相一致。烟雾暴露导致的氧化应激、补体激活、内质网应激和脂质异常等，都被认为与ARMD的发病机制有关。

吸烟对RPE细胞的损伤机制包括：(1)通过氧化应激和补体激活引起RPE细胞内质网应激和脂质积累。Kunchithapautham等[18]将RPE细胞暴露于香烟烟雾中，发现短时间细胞内ROS数量、补体成分C3、C3a分泌增加，同时细胞内内质网应激标志物增多，长时间出现脂质积累，而通过阻断补体受体及抗氧化治疗可以明显逆转这一现象。由此表明，暴露于烟雾中的RPE细胞首先释放C3，激活补体替代途径(alternative pathway，AP)，导致C3a分泌增加，触发C3a依赖的内质网应激，同时补体激活也会产生氧化应激，增加C3的释放，放大应激反应，长时间的内质网应激最终导致RPE细胞脂质积累。(2)与光协同对RPE细胞产生损伤。多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAH)是有机质不完全燃烧产生的副产品，是香烟烟雾中最具毒性的化合物之一，如茚并芘[indeno(1,2,3-cd) pyrene，IcdP]已被证实对RPE细胞有毒性作用。Zinflou等[19]模拟传输到视网膜的可见光谱，给予不同浓度IcdP处理的RPE细胞高能可见蓝光(high-energy visible blue，HEV)照射后，发现HEV和IcdP的结合导致细胞存活率呈剂量依赖性下降，细胞内线粒体管状结构和组织被破坏，线粒体网络完全丧失，同时细胞内ROS积累增多，细胞凋亡率增加。(3)吸烟导致RPE细胞发生自噬损伤。Bodas等用香烟提取物(cigarette smoke extract,CSE)处理RPE细胞后发现细胞内泛素化蛋白积累，且向核周聚集，导致细胞发生自噬损伤，而用自噬诱导物半胱胺或非瑟酮处理后可以显著降低CSE诱导的泛素化蛋白积累及其在核周聚集，减轻自噬损伤[20]。

3氧化应激

氧化应激已被证明是ARMD发病的一个重要机制[21]。ROS是生物有氧代谢过程中产生的氧离子、过氧化物和含氧自由基等一类副产品。视网膜是人体中耗氧率最高的组织，RPE细胞脂质过氧化产生的活性氧、光敏剂分子、强光照射及视网膜黄斑区的高氧张力均为细胞氧化应激提供了一个理想环境。作为氧化应激的防御反应，细胞内抗氧化基因的转录活性增加，抗氧化反应增强，但随着年龄的增长及持久的氧化应激，抗氧化反应受损导致RPE细胞功能障碍[22]。

氧化应激对RPE细胞的损伤主要包括：(1)RPE细胞线粒体DNA在氧化应激条件下易发生氧化损伤。线粒体基因组是ROS的潜在靶点，过量的ROS会破坏线粒体DNA、蛋白质和脂质，导致线粒体通透性转换孔打开，释放细胞色素C、线粒体蛋白、线粒体DNA和凋亡诱导因子到细胞质，继而引发细胞凋亡[23-24]。过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)产生的氧化损伤会导致RPE细胞线粒体内抗凋亡蛋白Bcl-2下调，促凋亡蛋白BAX上调，激活细胞凋亡内源性信号通路，细胞发生凋亡[25-27]。Terluk等[28]和Karunadharma等[29]研究表明RPE细胞中线粒体DNA损伤程度与ARMD的严重程度相关，表明线粒体DNA损伤对ARMD的发生起重要作用。(2)氧化应激导致RPE细胞内某些蛋白的表达发生变化。研究发现，RPE细胞经不同浓度H2O2处理后，细胞内三联组氨酸核苷结合蛋白1(histidine triad nucleotide binding protein 1，HINT1)的表达呈剂量依赖性下降，而HINT1下调参与诱导ARMD的发生，表明H2O2产生的氧化损伤通过抑制RPE细胞内HINT1的表达引发ARMD[30]。陈丽等[31]研究表明，H2O2能促进基质金属蛋白酶的表达，抑制基质金属蛋白酶抑制剂的表达，从而导致Bruch膜增厚、玻璃膜疣形成，诱发ARMD，而骨形态发生蛋白-6(bone morphogenetic protein-6，BMP-6)可逆转这种现象，阻止H2O2对RPE的氧化损伤，发挥细胞保护作用。(3)RPE细胞氧化损伤导致细胞内miRNA的表达发生明显变化，而差异表达的miRNA在细胞内通过调节抗氧化反应等途径减缓ARMD的发生[32]。梁厚成等[33]发现，RPE细胞受到不同程度的氧化损伤后，细胞miRNA表达发生明显变化，且部分miRNA表达变化与细胞损伤程度相关。Fas是一种与ROS介导有关的凋亡诱导配体，对RPE细胞稳态功能的维持发挥重要作用。正常情况下，Fas表达对细胞无害，但在病理条件下(如炎症和氧化应激)，Fas表达增加导致细胞死亡，而miR-374a作为Fas配体的靶点，可以阻止氧化条件下Fas上调而提高细胞存活率，保护RPE细胞免受氧化应激的损伤；此外，氧化应激条件下，miR-23a也通过Fas靶向保护RPE细胞成熟的miRNA[34]。(4)通过A2E介导的光照损伤引起RPE细胞凋亡。A2E处理的RPE细胞吸收一定波长的蓝光照射后，细胞产生大量活性氧，线粒体功能受损，同时细胞内抗氧化酶的mRNA表达下降，RPE细胞受到氧化损伤而凋亡[11]。

4脂褐素积累

RPE细胞的一项重要功能是吞噬光感受器外节脱落的膜盘，如果脱落的膜盘没有被及时代谢并在RPE胞浆内聚集，就会形成脂褐素，过多的脂褐素长期堆积将严重影响RPE功能，造成RPE衰老甚至凋亡，最终诱发ARMD。早有研究发现，干性ARMD中有脂褐素过度积累[35-36]。

脂褐素存在于RPE细胞溶酶体残体中，可自发荧光，A2E是脂褐素的主要荧光载体。脂褐素对RPE细胞的损伤主要包括：(1)介导光照损伤引起RPE细胞凋亡。蓝光照射含有脂褐素的RPE细胞后，A2E结构发生改变，并产生超氧阴离子、单态氧和脂质过氧化物等活性氧族，同时细胞内过氧化氢酶、超氧化物歧化酶及主要抗氧化酶活性降低，细胞受到损伤而凋亡[7,11]。(2)破坏RPE细胞膜。A2E由一份子氨基乙醇和两份子视黄醛合成，其分子结构包括一个亲水头部和两个疏水尾部，如同去污剂可以破坏RPE细胞膜的完整性。Gaillard等[37]通过研究推测，高浓度的A2E导致RPE细胞膜溶解破坏RPE细胞，继而造成光感受器细胞功能障碍或死亡。(3)抑制溶酶体对代谢物质的降解，降低RPE细胞的吞噬能力。Sundelin等[38]研究将德克萨斯红标记的牛光感受器外节膜盘分别与含有脂褐素(实验组)和不含脂褐素(对照组)的RPE细胞共培养1mo后，发现对照组细胞胞浆内含有大量红色荧光，而实验组荧光量却很少。(4)A2E光敏化导致RPE细胞DNA发生损伤。Wang等[39]向体外培养的RPE细胞中加入A2E，进行光照处理后，发现细胞DNA发生损伤，细胞内端粒异常数目增加及衰老相关分泌表型因子表达，RPE细胞发生衰老。(5)A2E抑制细胞增殖，诱导炎症相关因子和血管生成因子的表达。Zhang等[40]用A2E处理RPE细胞后，发现它以浓度和时间依赖性降低细胞活力，同时细胞内白介素、细胞间黏附因子等炎症因子及血管生成因子分泌增加，对细胞产生不良反应，而使用雷帕霉素可显著减少此类因子的分泌，保护RPE细胞。

5慢性炎症

炎症是与年龄相关疾病的常见病因，研究发现，慢性炎症与ARMD发生有关[41]。Kauppinen等[42]发现，ARMD患者中许多炎症介质[如细胞因子，补体因子和C-反应蛋白(C-reaction protein，CRP)]增加，这些介质负责炎症细胞的出现、炎性小体的激活、促进新生血管的形成和炎症过程的调节[43-44]。

细胞通过模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)识别各种内源和外源性病原体，当其被配体激活后，会迅速诱导细胞内信号通路激活，产生促炎介质，导致炎症的发生[45]。RPE细胞中，NLRP3炎性小体是负责识别病原体的受体，它长时间受多种诱导因子(如脂褐素和drusen成分)刺激，导致细胞内Caspase-1信号通路被激活，释放促炎因子白介素IL-b和IL-18，细胞发生程序性死亡[46-48]。NLRP3炎性小体对RPE细胞损伤主要包括：(1)在脂褐素介导的RPE细胞光氧化损伤中发挥作用。Brandstetter等[49]用蓝光照射含有脂褐素的RPE细胞后，发现细胞内溶酶体膜通透性增加，溶酶体酶向胞质渗漏，NLRP3炎性小体被激活，细胞炎性因子IL-1β和IL-18分泌增加，RPE细胞的光氧化损伤加重。(2)激活补体成分对RPE细胞产生损害。Jiao等[50]在光氧化损伤的小鼠视网膜中发现，补体成分C1q的表达及感光细胞死亡率增加，而在C1q敲除的小鼠视网膜中感光细胞死亡率明显减少，小鼠视功能提高，同时发现炎性小体NLRP3和IL-1β蛋白表达减少。表明C1q在视网膜中通过经典补体通路激活NLRP3炎症小体、分泌IL-1β细胞因子，引起视网膜损伤。并且发现，早期ARMD供体视网膜下小胶质细胞/巨噬细胞中C1q明显表达。

6蛋白质稳态

蛋白质稳态主要通过调节蛋白质的定位、合成、折叠和降解，维持细胞正常功能。调节蛋白质稳定的机制包括分子伴侣、泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system，UPS)和自噬溶酶体途径[51]。UPS和自噬溶酶体途径是清除细胞中受损和错误折叠蛋白的两种主要机制，其受损将导致细胞内有害脂质和蛋白质聚集物的积累，干扰细胞正常功能。研究发现，ARMD的发生与蛋白质稳态失衡有关[36]。

RPE细胞内蛋白质稳态失衡主要包括：(1)氧化应激增加ARMD患者中蛋白质错误折叠及脂肪、蛋白质聚集[52]。Baek等[53]和Mitter等[54]研究发现，自噬可防止视网膜受氧化应激损伤，而慢性氧化应激降低了RPE细胞自噬能力，导致细胞损伤加重。Liu等[55]发现光氧化应激降低了RPE细胞中UPS的活性，这种相互作用增加了编码促炎性白细胞介素IL-6和IL-8基因的表达，并下调抗炎基因单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)和补体因子H(complement factor H，CFH)，促进RPE细胞发生炎症反应。(2)香烟提取物CSE诱导RPE细胞内泛素化蛋白积累，且向核周聚集，细胞发生自噬损伤。而用自噬诱导物半胱胺或非瑟酮处理后可以显著降低CSE诱导的泛素化蛋白积累及其在核周聚集，减轻自噬损伤[20]。(3)脂褐素通过与RPE细胞内蛋白酶体和溶酶体蛋白酶的结合抑制氧化蛋白降解和蛋白酶体活性，从而损伤RPE细胞。脂褐素的主要成分A2E也可通过抑制自噬，对RPE细胞造成损伤[56-57]。(4)老化降低了RPE细胞线粒体自噬效率，导致受损的线粒体在细胞内积累，引起RPE损伤[58]。

7小结与展望

年龄相关性黄斑变性是造成老年人视力受损的主要眼部疾病，且随着人口老龄化不断加剧，干性ARMD患者日益增多。该病的发生与年龄、环境、遗传、吸烟、氧化应激和心血管功能障碍等都有关系，目前对于该病的治疗方法主要有激光治疗及眼用抗氧化剂，但只能延缓ARMD的发展，无法从根本上治疗干性ARMD，因此研究出新的治疗方案刻不容缓。视网膜色素上皮细胞的退化变性作为ARMD发生的重要病理基础，本篇综述从蓝光、吸烟、氧化应激、脂褐素积累、慢性炎症及蛋白质稳态六个方面总结了RPE细胞的损伤机制，这些因素中的任何一个都可能是导致干性ARMD发生的机制，但也可能包含多种因素的协同作用，如蓝光与氧化应激协同对RPE细胞产生损伤、吸烟通过氧化应激损伤RPE细胞、脂褐素积累导致细胞内蛋白质稳态失衡等。随着对干性ARMD的研究越来越深入，各种因素作用机制的贡献将得到进一步阐明，但对于充分了解各种因素协同对RPE产生损伤的具体关联机制及如何阻止脂褐素积累对RPE细胞的影响等，我们仍有大量的工作需要做。