非病毒基因载体脂质-聚阳离子复合物的研究进展

李 月，孙景鑫，孙丹丹，金 勇，全姬善

(延边大学药学院药剂学研究室，吉林 延吉 133000)

基因治疗是通过将正常的外源基因导入靶细胞，以补偿或纠正由于基因缺陷或异常所导致的疾病，从而达到治疗目的的一种治疗方法[1]。达到治疗目的需要3个必要的条件：合适的治疗基因、基因传递系统和基因表达[2]。治疗基因应具有特异性、高效性、低毒性和可调控性。基因传递系统包括基因载体和导入途径，是决定基因治疗能否进入临床的关键[2]。基因的表达是评价治疗效果的关键[3]。

基因载体分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体具有高转染效率，但具有免疫原性和毒性，储存困难，难以大规模生产,限制了它们的临床应用[4]。非病毒载体因其低毒高效、制备简单、易于修饰等优点成为当前研究的热点。其中，脂质-聚阳离子复合物作为一种新型的药物递送系统，具有细胞毒性低、转染效率高、生物相容性良好以及稳定性强的优势[5]。本文将就脂质-聚阳离子复合物的制备方法和在基因递送中的应用进展进行讨论。

1 脂质-聚阳离子概述

脂质体是应用最广泛的非病毒载体，被认为是迄今为止最成功的药物载体系统[6]。随着纳米技术的发展，高分子材料作为基因载体因具有独特的优点而备受关注。近年来，基于脂质的递送载体与基于阳离子聚合物的载体在表面改性、转染效率、内涵体逃逸机制和核酸释放等方面被广泛地研究。脂质体复合物与具有特定特征的阳离子聚合物基因纳米混合载体，二者的化学结构、脂质与核酸、聚合物与核酸的摩尔比直接影响递送系统的有效性，该纳米载体被称为脂质-聚阳离子复合物。其组成为[7]①包裹药物的聚合物：由不同聚合物、无机和有机材料组成；②围绕聚合物的脂质单层：充当分子屏障促进药物在聚合物核内部的保留，从而提高药物包封效率，增加药物载量和控制药物释放；③由脂质或聚合物共轭组成，有助于纳米粒子的表面修饰和功能化，延长循环时间，实现靶向特异性释放。有文献报道，阳离子聚合物与脂质体具有协同增效作用，并显示出了良好的稳定性、低细胞毒性以及高转染效率[8-9]。

2 脂质-聚阳离子复合物的制备方法

2.1 两步法

通常该方法制备过程有两步：首先制备聚合物纳米粒子，然后通过涡旋、超声处理以及加热等方法，将预先形成的聚合物与脂质体囊泡混合，两者通过静电作用相结合[10]。脂质-聚阳离子复合物制备方法有纳米沉淀法[11]、乳化-溶剂蒸发法[12]、高压乳匀法[13]、喷雾干燥法以及PRINT软光刻颗粒成型技术[10]。制备的影响因素包括脂质体的大小、多分散指数和表面电荷,脂质体和聚合物分散在连续相中的离子强度,以及脂质体与聚合物的比例[7]。两步法可有效控制纳米粒子的性质，但操作繁琐，耗时过长[14]。

2.2 一步法

与两步法相比，一步法具有操作简单的特点，更广泛地应用于脂质-聚阳离子复合物的制备。采用该方法制备的纳米粒子血液稳定性良好，药物包封率较高，可用配体修饰实现靶向功能，可控制药物释放速率[15]。以下对最为常见的乳化-溶剂蒸发法和纳米沉淀法作详细介绍。

乳化-溶剂蒸发法可根据包封药物的理化特性不同，进一步分为单步乳化法和双重乳化法[7]。若药物可溶于与水不溶的有机溶剂中时，采用单步乳化法;当药物不溶于任何有机溶剂时则选择双重乳化法[5]。乳化-溶剂蒸发法制备脂质-聚阳离子复合物的影响因素：脂体与聚合物的质量比、药物与脂质之间的离子相互作用[16]。

纳米沉淀法是将药物和聚合物分散到与水混溶的有机溶剂中，并将脂质或PEG修饰的脂质溶于水中。为了获得分散均匀的纳米粒，需要将水相加热到65～70 ℃。在连续搅拌的条件下，将聚合物逐滴加入到脂质水相中。由于疏水作用，有机溶剂蒸发后脂质在聚合物周围自组装成大小合适、分散均匀，稳定性良好的脂质-聚阳离子复合物[7]。Huang[17]提出纳米沉淀法影响纳米粒子大小的主要因素为聚合物的浓度、有机溶剂的选择、温度以及水相的离子浓度。大量实验证明，纳米沉淀法是技术比较成熟、可广泛应用的制备方法。

3 脂质-聚阳离子复合物在基因药物递送的应用

脂质-聚阳离子复合物结合了高分子聚合物与脂质体的优点。由于聚阳离子和脂质体的协同作用，形成的纳米粒子稳定性良好，且具有低细胞毒性和高转染效率[18]。静脉给药后，可以克服基因传递中复杂的生物障碍，包括血液稳定性、内吞作用、组织或细胞的特定靶向、内涵体逃逸、释放到细胞质和进入细胞核[18]。

3.1 基因药物的输送

脂质-聚阳离子复合物在被动靶向的基因递送研究中，被广泛证实具有低细胞毒性和高转染效率。Song[19]等制备不同的脂质-聚阳离子复合物载体递送DNA，证实脂质-聚阳离子复合物的核壳结构有助于药物有效传递。Ewe[20]等对荷瘤小鼠进行腹腔注射脂质-聚乙烯亚胺复合物后进行放射性生物分布的测定，证实该复合物可有效保护基因药物的递送，但未证实其生物相容性。Zhang[21]和Jilek[22]等建立原位肝癌异种移植小鼠模型证明脂质体-聚乙烯亚胺复合物可保护基因药物成功递送到肿瘤，且多次静脉给药后小鼠有良好的耐受性，肿瘤负荷减小，生命周期延长，进一步证实脂质-聚阳离子复合物用于体内基因药物递送的可行性。

此外，脂质-聚阳离子复合物可同时递送基因药物和磁共振成像的造影剂，如超顺磁性氧化铁纳米粒无创检测基因治疗过程，达到诊疗一体化效果[23]。

3.2 受体介导的药物输送

为了实现基因药物的有效递送，可通过不同的配体进行载体修饰。药物递送到癌细胞过表达的特定受体，可以增加细胞摄取，增加循环时间，减少非特异性相互作用，改善内体逃逸，并增强转染效力，实现功能化药物递送。Bruckheimer[24]等制备叶酸靶向的脂质-聚阳离子复合物递送基因药物，显示出特异性抗肿瘤功效，并且叶酸靶向的基因治疗可以减轻全身引起的炎症或免疫反应。脂质-聚阳离子复合物的肽成分和脂质体成分具有协同作用，促进细胞吸收以及基因药物的内涵体逃逸[25]。经证实转染效率高度依赖于靶向肽的序列[26]，将靶向肽配体附着在复合物表面上，提高对疾病靶标的选择性和转染效率。

非病毒类载体的转染效率低，目的基因只能实现瞬间表达，且形成的颗粒较大，容易被机体清除。由于质粒DNA和siRNA在长度和性质上存在差别，需要针对二者的特性对载体分别进行优化。带正电的基团包括聚阳离子、正电磷脂、壳聚糖、树状大分子以及多肽等，可中和DNA或RNA上负电磷酸基团，从而将基因压缩保护成复合物颗粒。聚阳离子的可调控因素有很多，比如电荷密度、结构性能、pH等[27]。脂质-聚阳离子作为一种新型的纳米载体，结合了脂质体和阳离子聚合物的双重优点，粒径小、稳定性好、具有缓控释给药和肿瘤靶向等优点，在肿瘤治疗和诊断成像中具有独特优势。但目前为止，针对脂质-聚阳离子复合物的复合动力学的研究仍旧处于初级阶段，虽然在制备方法简单易操作方面已取得进展，但距离大规模生产仍需努力。载体的安全性和稳定性也是当前存在的主要问题，还需对脂质-聚阳离子纳米粒采用低毒可降解的载体材料并进行长期稳定性评价。非病毒基因治疗领域的研究大多是在体外进行的，且体内外结果差异较大。因此应加大体内的研究数据，从而加快非病毒基因治疗的发展。