基于自噬探讨肝纤维化发病机制以及壮肝逐瘀煎的潜在干预作用▲

梁仁久 梁 尧 李建明 黄贵华

(1 广西中医药大学，南宁市 530200，电子邮箱：1060739511@qq.com；2 广西中医药大学第一附属医院，南宁市 530022)

【提要】 肝纤维化是各种慢性肝病发展为肝硬化的共同病理过程，其发病率和病死率较高，但治疗手段有限。近年来中医中药给肝纤维化的治疗提供了新思路。自噬是一种可降解受损细胞器或蛋白质的细胞过程，其参与了肝纤维化的发展过程。为此，本研究基于自噬对肝纤维化发病机制进行了总结，并针对肝纤维化有效方药壮肝逐瘀煎进行分析，以期为临床了解自噬与肝纤维化的关系，以及壮肝逐瘀煎通过调控自噬防治肝纤维化的潜力提供参考。

肝纤维化是各种慢性肝病发展为肝硬化的共同病理过程，其主要病理改变为细胞外基质过度沉积，降解相对不足。肝星状细胞是细胞外基质的主要来源，该细胞的活化是肝纤维化发生的关键环节。自噬是一种分解代谢的细胞内途径，其将有缺陷或过量的细胞器靶向降解为氨基酸、游离脂肪酸或其他的小分子。肝星状细胞的自噬理论已经成为目前肝纤维化研究的热点。中医药治疗肝纤维化的机制主要是抑制肝脏炎症、抑制肝星状细胞增殖、拮抗细胞因子、促进凋亡等[1]，但从自噬角度探讨中药疗效的研究甚少。为此，本文基于自噬探讨肝纤维化发病机制，同时探讨壮肝逐瘀煎[2-3]治疗肝纤维化的可能机制。

1 肝纤维化的研究概况

肝纤维化是各种病因引起的慢性肝病的愈合反应，其促使慢性肝病向晚期肝硬化甚至肝癌发展，目前缺乏有效的疗法。持续的实质细胞损伤导致肝内免疫细胞的募集以及致纤维化细胞的活化和积累。致肝纤维化细胞主要为肝星状细胞，其失去脂质滴(由维生素A组成的细胞质)后转分化为成纤维细胞[4]，后者为了限制肝损伤合成并分泌细胞外基质[5]。此外，肝星状细胞还产生降解细胞外基质的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)，以及特定的金属蛋白酶抑制剂来抑制MMP的活化[6]。简而言之，肝细胞损伤、免疫细胞募集和致纤维化细胞活化引起细胞外基质积累和降解失衡，最终导致肝纤维化。肝纤维在发生后的1～10年可发展为肝硬化，而肝硬化后7～10年的肝脏相关病死率达12%～25%[7]，但目前仍缺乏有效的临床疗法。

肝纤维化的发病机制很复杂，尚未完全明确，其中自噬是肝纤维化发生和发展的重要病理生理学机制之一，在肝纤维化形成过程中具有重要的作用。因此，以自噬理论为研究基础，探索肝纤维化的防治措施成为当前的研究热点。

2 自噬与肝纤维化发生、发展的关系

自噬作为一种分解代谢的细胞内途径，根据底物如何递送至溶酶体进行降解，分为3种类型，即大自噬、微自噬和伴侣介导的自噬，其中大自噬是主要类型。尽管自噬被认为是一种细胞保护机制，但过度自噬会导致细胞死亡，即Ⅱ型程序性细胞死亡[8]。有学者研究肝星状细胞在肝纤维化过程中的作用机制时发现，肝星状细胞通过接受自分泌或旁分泌信号转为高度活化、增殖、运动和收缩的成纤维细胞表型[9]，其限制了肝细胞损伤同时又导致了肝纤维化，这一过程与自噬理论颇为相似。自噬是一把双刃剑[10]，目前研究尚未明确自噬是否开启了细胞的程序性死亡或直接导致细胞的死亡，这需要更多的研究进行验证探索。

2.1 自噬与肝纤维化病理生理的关系 越来越多的证据支持自噬参与了许多人类疾病的病理生理过程，其中就包括肝纤维化。自噬损伤可通过减少缺陷细胞器和降解未折叠的蛋白，从而导致脂质氧化、过氧化物酶体自噬和内质网自噬。自噬能减轻肝细胞损伤，降低代谢水平从而减轻肝纤维化[11-14]。自噬的增加，减少了急性乙醇诱导的小鼠肝毒性和脂肪变性，同时血清炎症标志物和肝组织三酰甘油水平明显降低[15]。自噬可降解活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶[16]，从而减轻肝脏损伤，发挥抗纤维化作用。此外，α-1抗胰蛋白酶作为一种自噬增强药物，被证明可以减轻肝脏负荷并逆转纤维化[17]。总之，上述研究表明增强自噬可抑制肝纤维化。

2.2 自噬与肝星状细胞激活的关系 肝星状细胞中的磷脂酶D1可诱导自噬并抑制Ⅰ型胶原的积累[18]。另一方面，在肝星状细胞激活过程中自噬的程度增加，但这一现象可被自噬抑制剂巴佛洛霉素A1抑制[19]。此外，肝星状细胞的激活可被3-甲基腺嘌呤或氯喹阻断，这表明自噬和肝星状细胞的激活呈正相关，所以要达到抑制肝星状细胞激活的目的，可以通过中断肝星状细胞活化的各个阶段的自噬来实现[20]。Hernández-Gea等[21]的研究已表明，自噬通过激活小鼠和人体组织中的肝星状细胞释放脂质，从而促进纤维发生。还有研究表明通过药理拮抗作用来抑制自噬进程，或者抑制自噬相关基因(autophagy-related gene 5，Atg)5、Atg7的表达，也会导致纤维发生减弱[22]。同样，用四氯化碳或硫代乙酰胺干预后的小鼠，肝星状细胞Atg7基因的特异性缺失，这一过程保留了细胞内脂质液滴，从而显著减少组织纤维化[23]。这些结果表明自噬通过降解细胞内脂质小滴从而诱导组织纤维发生，这被称为脂质吞噬。

2.3 从自噬角度抗肝纤维化 众所周知，肝星状细胞在激活过程中会失去由维生素A组成的细胞质脂质小滴，从而从静止细胞转分化为活化的成纤维细胞。自噬增加可激活肝星状细胞和肝纤维化的进展。研究表明[24]，氧化应激介导的内质网应激有助于肝星状细胞中未折叠蛋白反应的活化，从而导致肝星状细胞活化。这些证据强烈表明自噬与肝星状细胞激活有关。因此，阻断自噬是控制或预防纤维化进展的治疗策略之一。

目前，已经有多种方法能抑制肝星状细胞中的自噬。尼罗替尼是一种酪氨酸激酶抑制剂，已被证明可通过抑制组蛋白脱乙酰基酶诱导细胞凋亡以及肝星状细胞的自噬，从而导致细胞死亡[25]。这意味着自噬的过程被抑制不仅降低了肝星状细胞的活化，还诱导了肝星状细胞的凋亡。还有学者发现，α-酮戊二酸二甲酯可通过抑制肝星状细胞的自噬减少四氯化碳诱导的肝纤维化[26]。此外，使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤治疗肝纤维化会引起肝组织α-平滑肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白表达显著下调，并导致细胞周期阻滞(G2期)，从而抑制肝星状细胞的体外增殖和活化[27]。因此，进行深入研究来阐明自噬抑制肝纤维化进展的具体机制具有一定意义。

转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1是肝纤维化的经典信号传导途径，其可诱导自噬[28]，提示自噬可能通过TGF-β途径参与纤维化。此外，TGF-β可能通过TGF-β活化激酶(TGF-β activated kinase，TAK)1-丝裂原活化蛋白激酶3-p38和TAK1-AMP活化蛋白激酶途径刺激自噬，导致纤维化反应[29]。还有研究表明在治疗肝纤维化过程中肝星状细胞的凋亡有助于减少活化的肝星状细胞的数量[30]。而MMP1和TGF-β的组织抑制剂也可作为抗凋亡信号，并促进肝星状细胞的存活[31]。

3 中医角度下肝纤维化与自噬的关系及壮肝逐瘀法的潜在干预作用

中医理论认为，“气是人体内活力很强、运行不息的极精微物质，是构成人体和维持人体生命活动的基本物质”，气的功能可以调节机体的“太过”和“不足”，以期达到机体的阴阳平衡[32]。自噬就如同中医中的阴阳，是机体对正虚邪实的一种自我调节方式[33]。在中医理论体系中肝纤维化并无确定的病名，但其病理产物的累积与中医湿、热、毒、浊的蓄积类似。

肝纤维化常为肝内阴血亏虚、瘀血阻滞、痰结湿聚、血热毒聚等日久纠结而成，是机体气血阴阳状态失衡的表现。细胞自噬是一种“自我消化”的过程，在一定条件下自噬被启动以维持基本的内环境稳态。因此，中医药常用滋补肝阴、化痰祛瘀、补气健脾、清热解毒等方法，通过启动自噬影响肝纤维化。《内经》认为肝为“刚脏”，肝脏较为特殊，在生理上“体阴而用阳”，而且在体用之中，“以体为本”，肝阴即肝“体”需柔、养、充，则肝“用”方能得到充养，肝气才能条达舒畅；肝用得行得助，亦有助于肝体的补养，肝病日久，可进一步影响脾肾功能，肝脾肾俱虚，至疾病末期自噬被启动，通过“自我消化”方式维持微环境的稳态[33]。日久湿、热、毒、浊留滞脾胃肝胆，肝脾肾运化疏泄不利，气机不调发，湿、热、毒、浊的留滞进一步导致全身津液气血无法正常运行，生痰生瘀，痰瘀湿热毒浊杂合留滞体内，致使肝络失养。湿、热、毒、浊在某种程度上与自噬相关联，湿、热、毒、浊既是病理产物也是致病因素，而自噬被激活后，可通过自噬溶酶体对代谢产物进行降解和“消化”。由此可见，肝纤维化的形成是中医理论中湿、热、毒、浊的微观表达，细胞自噬则是进行降解和清除的过程。

肝纤维化属中医学“臌胀”“积聚”“黄疸”“胁痛”等疾病范畴。中医肝病专家林沛湘教授认为，慢性肝病长期不愈，进展为肝纤维化的中医基本病机是肝虚瘀结。肝虚指肝脏的阴血亏竭，又兼脾肾不足，而瘀结乃瘀血及湿毒蕴结之意，故治疗应当以养肝扶正逐瘀解毒为要。扶正即是壮肝，以养肝之阴血为主，兼顾健脾益肾；逐瘀亦要兼顾化痰解毒。壮肝逐瘀煎是在林沛湘教授治疗慢性肝炎、肝炎肝硬化的经验方基础上发展而来的，组方包括灵芝20 g、黄芪20 g、当归10 g、绞股蓝20 g、炒鳖甲20 g、田七5 g、虎杖15 g。壮肝逐瘀煎由二组药物组成，一是补益药，体现养肝扶正的治法，当归、灵芝、鳖甲养益肝肾之精血，黄芪补中益气健脾，绞股蓝既益气扶正又具解毒之功；二是祛瘀解毒药，田七、地鳖虫、鳖甲等活血逐瘀，破积消癥，虎杖清热利湿，活血解毒[34]。课题组前期采用高脂低蛋白食物联合四氯化碳造模方法建立Wistar大鼠肝纤维化动物模型，发现壮肝逐瘀煎能加速活化的肝星状细胞凋亡，可明显抑制核因子κB mRNA的表达，增加肝星状细胞中凋亡因子磷脂酰肌醇激酶、蛋白激酶B的表达，改善肝组织的纤维化程度[35-37]。因此，壮肝逐瘀煎以自噬为新靶点抗肝纤维化具有可行性。

4 结 语

在系统开展壮肝逐瘀煎防治肝纤维化系列研究的基础上，本课题组前期研究表明壮肝逐瘀煎可能通过调控患者炎症反应、细胞凋亡等方面防治肝纤维化。自噬是细胞分解其自身成分的必不可少的稳态过程。然而，在复杂的多细胞生物中，自噬的核心分子机制―自噬蛋白，协调了细胞和生物对其他危险刺激(例如感染)反应的各个方面。最近研究显示，自噬途径和蛋白质在免疫和炎症中具有关键作用，同时，自噬和炎症共同调控着细胞稳态，影响着肝星状细胞的凋亡、活化途径从而调控肝纤维化的进程[38]。与课题组的前期研究的结果颇有相似之处，这开启了壮肝逐瘀煎疗效机制研究的新视角。因此课题组后续将以自噬为切入点严密开展体内、体外实验，从而为壮肝逐瘀煎有效干预肝纤维化提供多层次、多角度的疗效依据。