低深度全基因组测序技术在产前诊断中的研究进展

李奉瑾，姚欣雨，张玉萍

2012 年《出生缺陷防治报告》指出，我国出生缺陷发生率为5.6%[1]。据统计染色体病占出生缺陷遗传性疾病的80%以上[2]，是由染色体结构或数目异常导致的疾病。其中多数染色体数目异常可导致流产和死胎，仅少部分三体和性染色体异常可存活，而染色体缺失、重复等结构异常，特别是微缺失微重复结构异常所引起的疾病，在出生缺陷疾病中占很大比例。此类患儿智力低下、发育迟缓、多系统性畸形[3-4]，目前临床尚无有效治疗措施，给家庭和社会带来巨大的经济负担。

染色体核型分析技术是产前诊断的金标准，其实验周期长，不能检测5 Mb 以下的拷贝数变异（copy number variations，CNVs）。Wapner 等[5]研究发现在3 822 例核型正常的标本中，2.5%（96/3 822）存在致病或可能致病CNVs。Wang 等[6]对3 398 例羊水样本检测发现，3%（102/3 398）的样本存在致病性拷贝数变异（pCNVs），其中0.97%（33/3 398）CNVs 片段小于5 Mb。目前临床上用于CNVs 检测的技术是染色体微阵列分析技术（chromosomal microarray analysis，CMA），其分辨率高，可检测核型分析无法检出的微缺失和微重复，常用于检测产前超声异常但核型分析正常的胎儿[7]，已成为国外推荐的一线检测方法。但是CMA 的芯片探针设计有限，导致其对pCNVs 阳性检出率较低[8]，而且其通量低、成本高的特点限制了在我国的广泛应用，不能缓解我国产前诊断供给不足的压力。随着分子诊断技术的发展，低深度全基因组测序技术（copy number variation sequencing，CNV-seq）可实现对产前染色体微缺失、微重复的检测，检测成本较CMA 低，通量高，为临床提供了新的检测手段。

1 CNV-seq 技术原理及特点

CNV-seq 技术基于下一代测序技术，采用边合成边测序的原理，对样本DNA 进行全基因组水平的检测，将测序结果与参考基因组进行比对，进行生物学分析以发现受检样本的CNVs。与其他技术相比，CNV-seq 技术具有以下优势：①对样本DNA 量需求低，最低仅需10 ng DNA，在产前诊断样本的检测具有显著优势；②操作简便，自动化水平高，检测周期短，不需要进行细胞培养，可减少实验导致的误差；③检测范围广，可对全基因组CNVs 进行检测，分辨率精确至100 kb；④通量高，一次可上机检测70～80 个样本，有效缓解我国产前诊断供给不足的状况；⑤CNV-seq 检测与无创DNA 筛查（noninvasive prenatal testing，NIPT）可联合上机，同时使用同一台高通量测序仪，节省了实验室成本。但其也有一些局限性，CNV-seq 无法检测单亲二倍体、三倍体、多倍体、染色体平衡易位或倒位，也无法检测单个碱基突变导致的单基因疾病。

2 CNV-seq 在产前诊断中的应用

为检测CNV-seq 的临床适用性，Liang 等[9]对72 例样本检测得出CNV-seq 对已知致病CNVs与单核苷酸多态性微阵列技术（single nucleotide ploymophism array，SNP-array）检出率一致，还检测出SNP-array 未检出的次级CNVs（0.2～0.6 Mb）。2018 年，Wang 等[10]对3 429 例羊水标本前瞻性研究发现，CNV-Seq 检测出1.49%（51/3 429）致病或可能致病的CNVs，与CMA 对CNVs 检测的准确度一致[11]。与核型分析技术相比，CNV-seq 将染色体异常的检出率提高54.6%。2019 年《中华医学遗传学杂志》发表了CNV-seq 在产前诊断的专家共识，详细介绍了该技术的特点，规范了该技术的临床应用[12]。另有研究也证明了CNV-seq 在高龄、先天性心脏病、结构畸形、罕见染色体疾病等方面的检测具有良好的特异性[13-16]，进一步证实了其作为一线检测技术的应用价值，充分肯定了该技术的应用前景。

2.1 CNV-seq 技术在胎儿先天性心脏病（congenital heart disease，CHD）的应用CHD 是我国最多见的出生缺陷疾病，位居出生缺陷患儿疾病首位，占出生缺陷数的26.7%[17]。染色体畸变是CHD 的主要遗传因素，除外常见的非整倍体异常，染色体微缺失、微重复变异也可导致胎儿CHD 的发生。目前明确的与胎儿CHD 相关的染色体微缺失、微重复已超过40 种，常见的有22q11 微缺失、8p23 微缺失、7q11.3 缺失等。Jansen 等[18]研究发现除核型异常及22q11.2 微缺失外，在单一心脏畸形的胎儿中尚存在4%pCNVs。Zhu 等[19]采用CMA 和CNV-seq 技术对115 例胎儿CHD 的羊水标本检测发现CNV-seq 对CNVs 检测与CMA 的检测效能一致，该研究还发现18.3%胎儿CHD 与明确致病的染色体畸变有关，其中包括4 例罕见pCNVs。邓新娥等[20]用CNV-seq 对核型正常的胎儿CHD 进行产前检测，发现CNV-seq 技术额外检出9.2%的染色体畸变。郝晓艳等[21]对107 例圆锥动脉干畸形胎儿进行CNV-seq 产前检测发现22 例存在pCNVs。CNV-seq 可检测与CHD 相关的亚显微结构的微缺失、微重复，可发现罕见和新发的pCNVs，能检出CMA 无法检测的未知CNVs。

2.2 CNV-seq 技术在额外小标记染色体（small supernumerary marker chromosome，sSMC）中的应用sSMC 是传统染色体核型分析技术可发现但无法辨别其结构及来源的异常染色体片段，在产前诊断的发病率为0.077%[22]，可分为环状染色体、倒位重复、复杂重排及嵌合体型sSMC。与其有关的综合征包括Pallister Killian 综合征、猫叫综合征和Emanuel综合征等。荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）是检测sSMC 染色体来源的常用方法，但其不能准确检出未知染色体片段的变异位点及大小。张蔚卿等[23]报道1 例样本经常规G 显带分析提示核型为45,X[26]/46,X,+mar[43]，FISH 检测该sSMC 来源于着丝粒Y 染色体，通过CNV-seq 进行CNVs 检测明确变异位点在Yq11.22，存在42.88 Mb 缺失片段，最终确定为Turner 综合征的嵌合体核型。冯暄等[24]报道1 例胎儿核型分析示嵌合体型sSMC，CNV-seq 产前检测发现该样本12 号染色体p13.33-p11.1 存在拷贝数3.5、片段大小为34.70 Mb的嵌合重复区域，结合胎儿表型及检测结果确诊为Pallister Killian 综合征。CNV-seq 可对未知来源sSMC 进行检测，明确其遗传物质来源及大小，对嵌合体型sSMC 有独特的检测优势，可精确检测低至5%的嵌合体[25]。

2.3 CNV-seq 技术在流产组织检测中的应用流产组织因胚胎死亡时间长、绒毛中活细胞少等导致体外细胞培养失败率达10%～40%[26]。CNV-seq 技术不需对其进行细胞培养，可直接提取胚胎组织DNA，且对DNA 样本量需求低，有利于检测流产组织的染色体异常[27]。据统计核型分析正常的流产组织中15%存在pCNVs[28]。张建林等[29]对85 例绒毛组织检测发现，在核型分析正常的68 例标本中CNVseq 技术检测出2 例CNVs 和2 例嵌合体，细胞培养失败的16 例标本中检出4 例染色体畸变，核型分析难以确诊的1 例标本经CNV-seq 检测后确诊其核型。郭依琳等[30]对154 例流产样本分别用CNV-seq和CMA 检测后发现二者检出的染色体异常率差异无统计学意义（P=0.588），其中有2 例样本因绒毛组织DNA 量少（＜200 ng）导致CMA 检测失败，但CNV-seq 均检测出染色体异常。CNV-seq 技术可避免细胞培养，操作简便，所需样本量少，检测时间短，还可检测传统核型分析技术检测不出的染色体变异，提高染色体异常的检出率[31]。

3 CNV-seq 的结果解读

CNV-seq 技术的推广和不断发展有效地增加了pCNVs 的检出率，也带来了一定比例的临床意义不明的CNVs（variants of uncertain significance，VUS）和次要发现（即与临床主诉无关但具有临床意义的CNVs）。对CNV-seq 检测的结果解读和遗传咨询给临床医师带来了一定的压力和挑战，检测结果也可能造成孕妇和家属不必要的焦虑。2019 年美国医学遗传学会（American College of Medical Genetics，ACMG）新发布的CNVs 的解读与报告技术标准描述了CNVs 的分类和性质，阐明了与其分类有关的证据[32]。新指南为提高临床CNVs 解读的一致性，建立了统一判读CNVs 致病性的打分系统，通过半定量评分的方式对参考证据（包括CNV 区域包含的基因类别及数量、文献及数据库的相关案例、患者表型及家族史）进行评估，最后计算总分值再对应其分类。其中0.99 分以上为pCNVs，0.90～0.98 分为可能致病CNVs，-0.89～0.89 分为VUS，-0.98～-0.90 分为可能良性CNVs，-0.99 分以下为良性CNVs。VUS 类别较广泛，可能包括将来发现以其他证据证明为致病性或良性变异的结果。检测结果显示为VUS 可能与以下情况有关：①CNV 超过实验室的报告阈值，但在受影响的基因组间隔内没有基因；②一般人群中少数情况出现的CNV，但出现频率过低被认为是VUS；③含有少量基因的CNV，尚不清楚其是否为剂量敏感基因；④相关文献及数据库中报道为VUS；⑤单个基因内的CNV，尚不清楚其对转录本阅读框的影响。遗传医师应熟知各个证据的评分标准，严格按照指南进行分类评估，可参照评分证据对孕妇及家属进行结果解读，这样更有利于医患沟通，也可减轻孕妇的心理压力。在检测标本时还可发现与临床主诉无关但具有临床意义的CNVs，包括迟发疾病、与恶性肿瘤相关的变异和心血管相关疾病等，这些CNVs统称为次要发现。在进行CNVs 检测前临床医师需知情同意患者及家属会有次要发现的可能，ACMG建议对于次要发现仅报告pCNVs 和可能致病CNVs。

4 CNV-seq 与全外显子组测序技术（whole-exome sequencing，WES）

WES 技术是针对全部基因组的外显子区域进行深度测序，可涵盖基因组中的所有编码区域，用于检测单基因疾病、复杂疾病的致病基因及易感基因，但其不能检测染色体结构变异及全基因组CNVs。有研究表明WES 技术在单基因遗传病的检测上有独特的价值[33]，而胎儿多发结构畸形、神经系统异常、心血管系统疾病与单基因疾病的发生有一定的关系。2020 年ACMG 发布《胎儿外显子组检测技术在产前诊断中的应用指南》建议WES 技术可用于胎儿结构异常但核型分析及CNVs 检测均为阴性的补充检测[34]。在我国胎儿系统彩超检查时间为孕22～24周，如若进行常规产前诊断检测之后再进行WES 检测可能会造成孕妇孕周过大，延误终止妊娠的时机。临床医师可对产前超声提示结构异常的孕妇行CNV-seq 与WES 联合检测，缩短检测时间，提高产前诊断的准确度。

5 结语与展望

产前诊断是降低出生缺陷发生的有利手段，传统的染色体核型分析对实验操作和技术人员要求较高[35]，CMA 成本高、通量低，且不能覆盖所有的CNVs。CNV-seq 技术在分辨率、检测范围、通量及成本效益上均展现出独特的优势，已逐步应用于产前诊断、明确遗传学病因和流产组织检测等临床各个领域中。CNV-seq 技术的发展促进了我国产前诊断能力的提升，将CNV-seq 与其他技术合理地联合应用，优势互补，可充分发挥CNV-seq 的检测效能，从而提高产前诊断的效率。随着基因组学的迅猛发展和CNVs临床病例的积累，我们对CNVs 的认识也会越来越充分，从而丰富我国的CNVs 数据库，提高CNVs 解读的准确性，更有利于发现新的致病基因。相信随着技术的不断发展和成本的逐渐降低，CNV-seq 可能替代CMA 技术，显著提高我国的出生缺陷防控水平。