微纳尺度组织工程技术在骨缺损修复中的应用进展

刘 真，潘子杰，刘建恒，李 明，刘锺阳，孙国飞，崔 翔

(1.中国人民解放军总医院京南医疗区,北京 100073;2.中国人民解放军63650部队医院洛阳门诊部,河南 洛阳 471003； 3.中国人民解放军总医院骨科医学部，国家骨科与运动康复临床医学研究中心,北京 100853)

骨缺损是骨科的临床常见病。骨缺损长度在一定范围内时骨组织可自行修复重建，但是当缺损范围超过长骨直径的1.5倍(即为临界骨缺损)时，骨组织无法自行愈合[1]。全球每年因严重创伤、感染、骨折后治疗不当、骨肿瘤或先天性疾病等导致的大段骨缺损患者超过200万例，仅美国用于骨缺损治疗的医疗花费就>50亿美元[2]。

当前临界尺寸骨缺损治疗的金标准是自体骨移植[1]。然而，供区骨组织数量有限，术后供区骨缺损、疼痛、感染等多种并发症严重限制了自体骨移植的推广应用。近年来，骨组织工程技术在骨缺损治疗领域发展迅速，取得了良好的治疗效果。特别是微纳米尺度的生物支架可以更好地模拟天然细胞外基质的三维结构，具有良好的生物活性和机械性能，更好地促进成骨细胞的黏附、增殖和分化，是更理想的骨组织工程支架。因此，本文将对近年来骨缺损修复的微纳尺度组织工程支架制备技术进行综述，并对存在的问题及前景进行展望。

1 理想骨组织工程支架制备的要求

骨组织工程支架通过充当细胞外基质(ECM)在骨组织工程中发挥关键作用，为骨细胞的黏附、生长和维持自身生理功能提供了必要的机械支持和物理结构，是骨组织再生的关键要素之一[2]。理想的组织工程骨支架，首先必须具有良好的骨传导性以促进骨细胞的附着、增殖和迁移； 其次，还应具有良好的骨诱导性以刺激原始骨细胞向成骨细胞分化； 另外，理想的骨组织工程支架应具有血管化能力，通过改善营养和氧气的输送来促进骨组织再生。在微纳米尺度上制备的骨组织工程支架，孔隙率高、比表面积大，在结构和功能上能更贴近天然骨ECM，更加符合理想骨组织支架的要求[3-4]。

2 微纳尺度组织工程支架的传统制备技术

当前，微纳尺度支架是骨组织工程的研究热点。传统制备技术主要包括自组装技术和热诱导相分离技术[5-6]：(1)自组装技术是指微纳米材料成分自发组织形成一定模式或结构的技术。在自组装过程中，基本结构单元通过非共价键连接形成稳定并具有一定规则的几何结构。(2)热诱导相分离技术是高温下将聚合物溶解然后低温冷却，再通过萃取获得一定结构形状的聚合物微孔膜。然而，自组装技术或热诱导相分离技术制备的支架孔径较小甚至无孔径、三维结构不够稳定、力学性能较差，并且支架的降解性能也需要验证。因此，上述技术目前在骨组织工程领域已不再单一使用，逐渐被新兴技术所替代[7]。

3 新型微纳尺度骨组织工程支架制备技术

静电纺丝、3D(生物)打印和微流控是近年来制备微纳尺度骨组织工程支架的常用技术，可以弥补传统技术上的一些不足，更适宜用于理想骨组织工程支架的制备。

3.1静电纺丝 静电纺丝技术可简便有效地制备微/纳米纤维支架，其基本原理：聚合物溶液(或熔体)在高压静电作用下，利用电场力克服其表面张力形成喷射状细流，细流在喷射过程中溶剂挥发，在收集器上固化形成微/纳米纤维膜。静电纺丝技术优势：(1)方法直接简便、成本效益较好。静电纺丝技术操作简单、成本低廉，原料适应性广。多种高聚物均可以用静电纺丝技术生产微/纳米纤维，包括合成高聚物、再生纤维素以及天然高聚物，如丝素或羊毛蛋白等蛋白质类高聚物。针对热塑性聚合物原料还可以采用熔体静电纺丝法来生产微/纳米纤维，且该技术生产速度比其他微/纳米纤维生产技术要快许多[8]。目前，静电纺丝技术是唯一可以用来规模化生产微/纳米纤维、且适合于制备各种聚合物微/纳米纤维的组织工程技术。(2)电纺纤维膜孔隙率高、纤维细度和均匀度高、比表面积大、长径比高，是一种可以模拟天然骨ECM的胶原纤维网络结构。Chakraborty等[9]通过使用90∶10(v/v)丙酮-水溶剂系统优化该技术，生产出高度多孔的再生纤维素纳米纤维，支持成骨细胞的增殖和黏附。Zhao等[10]通过电纺纤维技术制备了由聚乳酸、明胶和糖胺聚糖组成的合成/天然混合聚合物纤维网，该纳米纤维网形态均匀，平均直径<300nm，纤维膜空隙率高，且表面粗糙度与天然骨相似，较好地模拟了天然骨纤维的ECM结构，可以很好地促进软骨修复。(3)电纺纤维表面易功能化，可根据不同需求载入聚合物、无机物和生物大分子等，扩大了支架的应用范畴。例如多种药物、生长因子等可以通过与高分子聚合物混纺固定在纤维表面，形成生物活性涂层，在保持生物活性的同时达到局部缓释的目的。Mohammadi等[11]在静电纺丝技术制备的支架上负载BMP-2，结果显示通过BMP-2的持续释放促进了脊髓间充质干细胞黏附和增殖，从而促进成骨分化，是优秀的骨组织支架。

为了制造具有创新结构和性能改进的复合纳米纤维，科学家们又进一步提出了同轴静电纺丝技术。同轴静电纺丝技术可将聚合物[12-13]、低聚物[14]、无机化合物[15]、蛋白质[13]和生物分子[16]等各种材料包覆在核壳结构的核芯中。由于核芯成分和功能不同，核-壳纳米纤维在构成骨组织工程支架后展现的特性也不尽相同。Shao等[17]制作了以纤维蛋白杂交的羟基磷灰石为纤维核芯，柞蚕丝蛋白为壳的同轴电纺丝纤维，实验证明该纳米纤维机械强度高，有效支持了成骨样细胞MG-63的增殖并促进了支架的生物矿化。Silva等[18]制造了结合聚癸二酸甘油酯(PGS)/聚己内酯(PCL)的纳米纤维(核芯：PGS/壳：PCL)，同时把可促进骨髓间充质干细胞形成软骨的通路激活剂Kartogenin(KGN)负载于PGS溶液中。结果显示KGN能够在支架局部可控、持续释放，且显著促进了成骨细胞的增殖分化和软骨的形成。

虽然静电纺丝技术已推出十多年，并且广泛用于骨组织工程研究。但这种常规方法仍然存在局限性，例如电纺纤维无规则的取向、缺乏拉伸强度以及纤维直径范围大，均在一定程度上限制了骨组织支架的适用性。收集器是静电纺丝中的重要组成部分，可通过调节收集器的速度来制备定向纳米纤维。对齐的纳米纤维有助于指导细胞黏附的顺序，并促进细胞渗透、增强细胞活力。Ma等[19]制造了定向的聚乳酸(PLLA)纳米纤维与骨髓基质(BMS)细胞的复合支架，使细胞黏附性得到了明显增强。如何将纤维平均直径降低到20nm以下是静电纺丝技术面临的另一个挑战。作为静电纺丝全新的研究领域，电纺/网织(ESN)技术能够生产纤维直径<20nm的纳米网，其机械性能更好，比表面积大且孔隙率高，可作为组织再生支架的合适候选者[20]。普通静电纺丝方法制备的骨组织支架通常由一维纳米纤维作为构筑单元组装而成，具有结构难以精确调控、固有纳米特性难以保持等局限性，限制了纳米材料应用性能的大幅提升。Zhang等[21]提出了一种高分子网状纤维材料的新型加工技术—“静电喷网”，获得了纤维直径10～40nm的二维纳米网络结构材料。二维纳米网络结构不仅赋予了材料孔径小、比表面积大、孔隙率高等纳米特性，同时显著增强了材料的机械性能，在骨组织工程领域将有优异的应用潜力。

静电纺丝技术在医学再生支架方向的应用取得了令人瞩目的进展，利用静电纺丝技术可以成功地制备出结构功能多样的纳米纤维支架。下一步可以通过材料改进、技术创新或与其他先进技术结合等方法，制备结构更优、机械性能更好、生物活性更强的静电纺丝支架，更好实现骨缺损的修复。

3.23D生物打印 3D打印是在计算机的控制下，把数据模型按照设定方式，层层打印堆叠成立体实物的一种成型方式。3D打印作为精准医学的重要技术，在骨缺损的治疗中已取得初步成效[22]。3D打印可根据不同患者个性化定制支架，实现支架与骨缺损部分的完美匹配。传统3D打印技术虽然可精确控制支架的形状、孔隙率、孔径尺寸等，但打印过程中需进行高温或其他特定处理，无法实现打印支架材料与生物活性材料(如细胞、生长因子、蛋白质等)相结合。近年来随着3D打印技术的不断发展，生物打印技术应运而生。该技术可以打印活细胞、生长因子、蛋白质等生物活性分子以及具有良好生物相容性且可降解的生物材料，因此成为骨组织工程领域的研究热点[23-24]。

目前3D生物打印技术根据原理可概括为三类：喷墨式生物打印、微挤压成型式生物打印和激光辅助生物打印。

(1)喷墨生物打印：该技术是基于普通喷墨打印机的打印原理，依靠热或声波挤压墨盒内的生物墨水，离散墨水成微滴并喷射出去。喷墨式生物打印的主要优势是打印速度快、成本低。该技术通过喷射的方式可以打印流体材料，因此具有很高的材料适用性； 同时通过精确沉积细胞和生物材料可以实现接近50μm的分辨率[25]。另外，喷墨式生物打印可针对性地配备多个喷嘴，以满足在同一时间打印不同的细胞、生物材料或生长因子的需求[26]。然而，用于喷墨打印的生物墨水黏度要求限制了其适用生物材料的范围。由于驱动压力小，喷墨生物打印无法打印高黏度材料或高浓度细胞，而低黏度材料会降低骨组织支架的机械强度，不能满足后续体外培养和移植的要求； 此外，喷墨打印过程中可能会对细胞造成机械或热损伤，喷头也易损耗，这些缺点限制了喷墨生物打印技术的广泛应用[27]。

(2)微挤压3D打印：该技术工作原理是通过力学的推进，可控地将材料从喷口或针头挤压出来并沉积成预设支架。其最大的优势在于可打印的生物相容材料范围广泛，这意味该技术不但可打印为维持细胞活力和功能化提供合适ECM的低黏度材料，也可打印能为骨支架提供力学支持的高黏度材料[26-28]。同时，微挤压生物打印也有良好的经济性和易用性等优点，可以选择不同的针头大小，并且调节温度和压强来控制打印速率和分辨率。但微挤压打印也存在一些缺陷：首先，其打印精度相对其他3D生物打印方式较低，一般在50～500μm； 其次，挤出过程中不可避免的剪切力可能会影响细胞存活率； 另外，打印材料黏度很高时，打印针头容易堵塞[29-30]。

(3)激光辅助生物打印：该技术原理是利用激光使含有细胞的聚合物产生交叉链接，从而硬化形成固体。激光投射能够达到很高的精确度(分辨率<5μm)，因此可以打印复杂的形状及结构[31]。激光辅助式生物打印相较于前两者有着一个先天优势：其无喷嘴的打印模式避免了细胞/生物材料堵塞喷嘴的问题，同时也避免了生物墨水与器件的直接接触，不会对细胞造成机械损伤； 另外，其生物材料的选择范围比喷墨打印更广，可以打印超高黏度生物墨水，打印精度甚至能达到生成含单个细胞的液滴。而激光辅助打印也存在以下缺陷：(1)在印刷过程中，金属激光吸收层蒸发，金属残留物可以在最终的组织工程产品中找到[31]； (2)印刷速度相对较慢； (3)单次打印对打印材料的利用率不如喷头类打印高，在成本控制方面没有很大竞争力[28]。

针对不同需求，研究者们利用3D打印技术开发了各种用途的纳米骨组织支架。例如，为了突破细胞和生长因子只能单独应用于支架上的局限性，Gao等[32]设计了一种改进的热喷墨生物打印技术。该技术可将干细胞、纳米颗粒和生物材料同时沉积在精确的3D位置。Costa等[33]采用激光辅助打印技术生产了由PCL和poloxamine结合的负载地塞米松的3D打印支架，经证明该支架能够长期可控地把最佳量药物递送至靶细胞，促进成骨细胞分化。

3D生物打印技术在骨再生领域应用最为成熟，可以更加精确地控制支架结构和机械性能。但目前仍需克服一些技术难题，例如必须要提高生物打印机的分辨率才能打印出更加仿生的结构。另外当前的生物打印过程非常耗时。复合材料和混合3D打印可以改善传统3D打印的一些限制条件(如材料选择)。此外，还可以与其他实验室技术(如微流控)结合使用，以改善骨骼的微环境并控制流体网络的结构。

3.3微流控 微流控是指一种可以精确操控数十微米尺度流体的组织工程技术，能够把生化分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析过程[34]。微流控技术在制备骨组织工程支架方面有以下优势。

(1)微流体系统可以在生产过程中对微纤维进行精确的尺寸和形态控制。微流体技术通过对微通道中微尺度液体流动的精确操控，可对形成的微纤维在尺寸和形态上进行精准控制。Angelozzi等[35]采用了双入口蛇形微混合芯片使细胞与藻酸盐-明胶水凝胶及藻酸盐-膀胱基质水凝胶均匀分布在微纤维内，该支架可以促进细胞黏附、增殖和成骨分化，从而促进骨形成。微流体系统基于芯片的制造方法具有简单、经济、生物相容性好的优点。Santo等[36]就利用这些优点设计了一种由血小板裂解物和甲基丙烯酸化结冷胶纤维组成的纤维状水凝胶支架，在保持支架机械力的同时改善了细胞黏附和增生，可作为理想骨支架的选择。

(2)微流体可以控制微气泡的尺寸分布。在生产实心微纤维材料的基础上，通过在微流控技术产生的柱状喷射液流模板中引入致孔剂或使用溶剂挥发法，可以得到具有多孔结构的微纤维。Colosi等[37]研发了一种能够产生高度单分散气泡的微流体气体发泡技术，制备出孔隙均匀的多孔支架，以利于营养物质和气体的扩散，促进骨支架的血管化形成。

(3)微流体平台可在体外创建精确的骨微环境。微流体技术能够创建对机械和化学参数(例如流速和相关的感应力、氧气张力、化学梯度和温度)进行精确控制的微型设备。这些微装置可以模拟不同的体外生物学和细胞微环境条件，以用于各种研究[34]。

另外，微流体还可用于生产纳米颗粒。Hasani-Sadrabadi等[38]使用微流体技术生产包覆地塞米松的壳聚糖纳米颗粒，研究表明这些纳米粒子比常规合成的纳米粒子的尺寸更小且均匀，包覆的地塞米松可在细胞内持续缓慢释放，促进成骨细胞分化。

血管生成是组织工程中的关键问题。Del Amo等[39]使用微流控平台作为模型来量化评估不同血管生成因子对1型胶原蛋白支架发芽的影响。最终发现，BMP-2是唯一在较长时间内具有正向调控性的生长因子。Jusoh等[40]为改善血管生成在微流体平台上建立了一个结合羟基磷灰石和纤维蛋白水凝胶的3D微血管网络模型。研究结果表明，羟基磷灰石和纤维蛋白水凝胶的结合可以增加支架的刚度，更好地引导3D环境中内皮细胞的伸长和发芽。

迄今为止，微流体装置在骨组织再生方面的应用潜力仍未被充分开发。而复杂的微流体平台通过使用新颖的微/纳米工程技术和计算模型可以优化生物支架的细胞基质和微环境。因此，该技术的出现将极大地推进仿生组织工程的发展。

4 挑战与展望

随着骨缺损患者数量的逐年增加，寻找自体骨移植更适宜的替代方法成为目前研究的热点。研究者们开发了由仿生支架、干细胞和生长因子组成的骨移植替代物，并且骨组织工程支架和各种材料的研究已取得了重大进展。目前，静电纺丝、3D生物打印、微流控等技术已成功地应用于微纳米尺度的骨组织工程领域，许多报道已证实这些技术制备的支架可更好促进成骨细胞黏附、成骨分化和组织形成，展示出强大的骨缺损修复能力。

迄今为止，开发具有真正临床意义的骨支架仍然面临很多挑战。首先，达到理想骨组织工程支架的要求要顾及很多方面，例如支架的血管化能识别适当的机械刺激，调节生物活性剂和生化试剂的可控释放，改善嵌入支架的细胞植入等。上述每个方面的优化均是一个复杂过程，也需要大量的临床经验。其次，在大规模生产的同时要保证符合良好的生产规范，并具有较高成本效益和临床安全性。最后是生产制造协议的标准化，需要考虑到政府相关组织的审批、成本效益等方面的问题。

今后随着多学科交叉的不断深入，将生物学、工程学和材料学相融合； 临床医师和生物工程师的密切合作以及新兴技术如计算机建模等的不断出现，组织工程支架将会迎来更好更快的发展。相信在不久的将来，更加符合骨缺损修复要求的理想人工骨移植材料将会应用于临床，为大段骨缺损的治疗提供新思路，造福广大患者。