不同量生物炭施用与蚯蚓互作对土壤N2O及CO2排放的影响

刘 椒，那立苹，张 琳，陈云峰，孙福来，伍玉鹏①

(1.华中农业大学资源与环境学院，湖北 武汉 430070；2.北京师范大学环境学院，北京 100875；3.农业农村部废弃物肥料化利用重点实验室，湖北 武汉 430064；4.滨州市农业农村局，山东 滨州 256600)

N2O和CO2是导致全球气候变暖的主要温室气体。大气中每年有5%～20%的CO2和80%～90%的N2O来源于土壤，其中农田土壤每年释放的N2O和CO2的量可达3.3和1.4 Tg[1]。如何降低农田土壤温室气体排放，已成为减缓全球气候变暖的关键问题之一。

生物炭因其高度稳定性和较强的吸附性能，在N2O和CO2等农业温室气体减排方面具有较大的应用潜力[2]。Meta分析显示，施用生物炭平均可降低我国主粮作物农田土壤41%的N2O排放，尤其在旱地中施用生物炭效果更为明显[3]。柯跃进等[4]也指出，施用生物炭降低耕地土壤CO2排放量的潜力可高达41%。也有小部分研究发现生物炭施用并未显著影响土壤温室气体排放，甚至导致土壤温室气体排放增加，但研究者多将这归咎于生物炭施用量或生物炭性质的差异[5]。一般认为，生物炭施用量越大，其对温室气体减排效果就越明显[6]。已有研究表明，生物炭影响土壤温室气体排放的机制包括提高土壤pH 值[7]，增加土壤透气性[8]和吸附作用[9]，及对土壤微生物的影响[10]几个方面，均主要从土壤物理、化学和微生物方面开展研究，却很少从土壤动物角度进行探讨。

蚯蚓是最常见的大型土壤动物之一，被称为“土壤生态系统的工程师”，能够通过取食、排泄、分泌和掘穴等活动直接或间接地参与土壤碳、氮循环的整个过程[11]。Meta分析显示，蚯蚓能够增加土壤30%～56%的N2O排放和33%的CO2排放[12]。已有研究认为，蚯蚓促进N2O和CO2排放的机制包括蚓粪形成的排放热点[13]、蚯蚓对土壤孔隙度的改变[14]、蚯蚓对土壤有机物质的矿化作用[15]及蚯蚓对土壤微生物群落结构的影响[16]。而蚯蚓生态类型[17]、土壤表层有无植物残体[18]及是否施肥等因素[19]，则是影响蚯蚓作用下土壤温室气体排放的重要因素。虽已有研究证实生物炭施用能够对土壤动物的行为特征产生影响[20]，但不同量生物炭施用与蚯蚓作用对土壤N2O和CO2排放影响的研究却鲜见。

因此，笔者拟通过室内培养试验研究不同量生物炭添加与蚯蚓互作条件下土壤N2O和CO2排放变化，并结合土壤微生物生物量碳(MBC)、溶解性有机碳(DOC)、无机氮和pH等指标的变化探讨其可能的作用机制。研究结果将有助于从大型土壤动物角度进一步揭示生物炭施用对土壤N2O和CO2排放的影响机制，亦能够为生物炭在农业温室气体减排上的应用提供理论依据，拓展生物炭施用条件下土壤动物介导的土壤碳、氮循环过程研究。

1 材料与方法

1.1 材料

供试土壤及蚯蚓同时采集自湖北省当阳市半月镇凤凰山柑橘试验基地。采样柑橘园长期施用商品有机肥并种植绿肥，土壤中蚯蚓种群密度为36条·m-2，蚯蚓优势种为Amynthasheterochaetus。取0～20 cm土壤过5 mm孔径筛以剔除石块和植物根茬，将土壤含水率调整为20.8%(与采样时土壤含水率一致)备用。采集鲜土开展试验以最大限度保证土壤原始状态的化学和生物学性质。试验开始前土壤pH为5.39，土壤有机质(SOM)质量含量为26.77 g·kg-1，土壤铵态氮(NH4+-N)质量含量为1.23 mg·kg-1，土壤硝态氮(NO3--N)质量含量为22.36 mg·kg-1。

利用挖掘手捡方法采集土壤中蚯蚓优势种，挑选性成熟且大小一致的个体做驯化处理备用，并于试验开始前1 d进行清肠。

生物炭购买自南京智融联科技公司。生物炭相关理化性质如下：全碳(TC)质量含量为62.18%，全氮(TN)质量含量为2.17%，灰分(ASH)质量含量为14.5%，pH值为8.8，密度为0.24 g·cm-3。

1.2 试验设计

采用室内培养方法，共设置仅有土壤(S)、接种蚯蚓(SE)、施用低剂量生物炭(SL)、接种蚯蚓并施用低剂量生物炭(SLE)、施用高剂量生物炭(SH)和接种蚯蚓并施用高剂量生物炭(SHE)6个处理，每个处理设置3个重复。

在2.5 L玻璃瓶中放入鲜土986 g(折合干土800 g)，随后按照试验设计，在施用低剂量生物炭处理中充分混匀8.0 g生物炭(土壤干重的1%)，在施用高剂量生物炭处理中充分混匀40.0 g生物炭(土壤干重的5%)，在接种蚯蚓处理中接种蚯蚓2条(折合约60条·m-2)。随后将玻璃瓶置于室内常温培养50 d。培养过程中每个玻璃瓶均用黑色塑料袋进行遮光处理，同时利用橡皮筋将瓶口用带有小孔(1.5 mm)的塑料薄膜封住，在防止蚯蚓逃逸的同时也保证能够与外界有良好的气体交换。在培养过程中通过称重法调节土壤含水率保持稳定。

1.3 取样与测定

气体：培养开始前9 d每天采集1次气体样品，随后隔1 d采集1次直至培养结束。采集气体时，先利用风扇对玻璃瓶通风10 min以保证瓶子内外气体一致，然后用带橡胶管的胶塞塞住瓶口，密闭状态下培养1 h，利用注射器连接橡胶管，打开夹子，抽取瓶中气体。气体样品采集后在当天完成测定，采用气相色谱仪(GC-7890A，Agilent，USA)分析CO2和N2O浓度。

土壤：培养4、8、15、25、35和50 d时利用特制小口径土钻小心垂直取土壤样，以尽量避免对土壤造成过大的扰动而影响气体排放或对蚯蚓造成伤害。培养35 d时进行破坏性取样。用蒸馏水浸提土壤DOC后离心，上清液过0.45 μm孔径滤膜后用TOC仪(Vario TOC，Elementer，Germany)测定。土壤NH4+-N和NO3--N含量用KCl溶液浸提后采用靛酚蓝比色法和紫外分光光度法测定。土壤无机氮含量为NH4+-N和NO3--N含量之和。土壤MBC采用氯仿熏蒸法测定。土壤pH值采用pH计(PHSJ-4F，雷磁，中国)测定。

蚯蚓：在培养结束后进行破坏性取样，对蚯蚓存活情况进行计数，并在蚯蚓吐泥后用称重法测定蚯蚓生物量。

1.4 统计与分析

温室气体通量计算公式[21]为

f=ρ×(V/m)×(△c/△t)×(273/T)×β。

(1)

式(1)中，f为气体排放通量，μg·kg-1·h-1N2O-N或mg·kg-1·h-1CO2-C；ρ为标准状况下的气体密度，kg·m-3；V为培养瓶中气体所占有效体积，m3；△c/△t为特定时间内气体浓度变化速率，10-6h-1；m为培养瓶中土样干重，kg；T为绝对温度，K；β为由气体转换为元素C或N时的转换系数，N2O和CO2分别为28/44和12/44。

气体累积排放量通过内插累加法获得[22]。该方法假设在2个已知测量时间点之间气体的排放变化为线性关系，利用相似三角形原理计算内插点获得数据。

试验结果以均值表示，采用SPSS 17.0统计软件对CO2和N2O累积排放量等指标进行方差分析(two-way analysis of variance)，对蚯蚓因素和生物炭因素进行主体间效应检验。

2 结果与分析

2.1 蚯蚓存活率及生物量变化

培养结束后，所有接种蚯蚓处理瓶中蚯蚓均全部存活，存活率为100%，但蚯蚓生物量均呈现下降趋势(表1)。与接种前相比，SE处理蚯蚓生物量下降18%，SLE处理蚯蚓生物量下降26%，而SHE处理蚯蚓生物量下降高达37%。至培养结束，施加生物炭显著降低蚯蚓生物量，且随着生物炭添加量的增加，蚯蚓生物量下降越显著(P<0.05)。

表1 各处理蚯蚓存活情况

S为仅有土壤，SL为施用低剂量生物炭，SH为施用高剂量生物炭，SE为接种蚯蚓，SLE为接种蚯蚓并施用低剂量生物炭，SHE为接种蚯蚓并施用高剂量生物炭。“—”表示无数据。就相同处理而言，同一行数据后英文小写字母不同表示培养前后某指标差异显著(P<0.05)。

2.2 蚯蚓与生物炭相互作用对土壤N2O、CO2排放通量及累积排放量的影响

图1显示，试验开始后接种蚯蚓处理(SE、SLE和SHE)N2O排放通量快速上升，随后呈波动状下降并逐渐平稳。相对地，无蚯蚓接种处理(S、SL和SH)在整个培养过程中均无明显的N2O排放。培养结束后，接种蚯蚓处理(SE、SLE和SHE)N2O累积排放量分别为589.8、538.0和258.3 μg·kg-1，均显著高于未接种蚯蚓处理(S、SL和SH 处理N2O累积排放量分别为57.1、34.5和23.4 μg·kg-1)(P<0.05)(图1)。就无蚯蚓处理而言，添加生物炭显著降低N2O累积排放量，但不同添加量之间无显著差异。就接种蚯蚓处理而言，添加生物炭显著降低N2O 累积排放量，且不添加、添加高剂量和添加低剂量生物炭处理之间均存在显著差异(P<0.05)。

总体来看，各处理CO2排放通量变化趋势与 N2O 排放通量变化趋势类似，即培养前期CO2排放较高且呈波动状，后期趋于平缓，但接种蚯蚓处理(SE、SLE和SHE)CO2排放通量高于未接种蚯蚓处理(S、SL和SH)(图1)。培养结束后，接种蚯蚓处理(SE、SLE和SHE)CO2累积排放量分别为686.1、682.2和420.7 mg·kg-1，均显著高于未接种蚯蚓处理(S、SL和SH处理CO2累积排放量分别为346.9、268.7和165.9 mg·kg-1)(P<0.05)(图1)。添加生物炭降低了接种蚯蚓处理CO2累积排放量，但仅高剂量生物炭添加(SHE)与无生物炭处理(SE)间存在显著差异(P<0.05)(图1)。

2.3 蚯蚓与生物炭相互作用下土壤微生物生物量碳及土壤化学性质的变化

虽然接种蚯蚓处理(SE、SLE和SHE)在培养前期表现出更快的MBC上升趋势，但整体来看，各处理之间在MBC变化趋势上并无显著差异(图2)。在整个培养过程中，未施用生物炭处理(S和SE)DOC含量在大部分时间均低于其他处理，但各处理之间在DOC含量变化趋势上并无显著差异(图2)。

各处理pH均呈波动上升趋势，但施加高剂量生物炭处理(SH和SHE)在培养前期pH上升迅速，并从第15天开始显著高于其他处理(图2)。施加低剂量生物炭处理(SL和SLE)pH高于未施加生物炭处理(S和SE)，但仅在35 d时观察到显著性差异(P<0.05)。同一生物炭施加量条件下，接种蚯蚓与否未对pH产生明显影响。

各处理无机氮含量在培养初期(0～8 d)均保持较稳定，但从8 d后接种蚯蚓处理(SE、SLE和SHE)无机氮含量开始逐渐上升，而其他处理则仍旧保持稳定，甚至下降(图2)。无论是否接种蚯蚓，在8 d之后的培养过程中，与对应的无生物炭处理相比施加生物炭均降低了土壤无机氮含量，且施加量越大，无机氮含量下降越多。

对蚯蚓因素(包含两个水平：有/无蚯蚓)和生物炭因素(包含3个水平：无/低/高剂量生物炭)进行主体间效应检验，结果显示蚯蚓对N2O和CO2累积排放量和土壤无机氮含量表现出极显著作用(P<0.01)(表2)。生物炭施加对N2O和CO2累积排放量和土壤DOC含量、pH表现出极显著作用(P<0.01)，对土壤无机氮含量表现出显著作用(P<0.05)。而蚯蚓和生物炭施加交互作用下仅对N2O累积排放量表现出极显著作用(P<0.01)。

表2 N2O、CO2累积排放量及土壤性质的主体间效应检验

3 讨论

前人调查显示，我国土壤中蚯蚓密度可高达277条·m-2，为加快培养试验中的蚯蚓作用过程，笔者采取接种高于田间实际蚯蚓密度的方式开展试验[23]。此外，笔者研究并未额外为蚯蚓提供食物。因此，食物短缺与蚯蚓个体之间的竞争可能是导致笔者研究中蚯蚓生物量下降的主要原因，这一现象在前人的蚯蚓培养试验中亦有报道[24]。但施加生物炭处理蚯蚓生物量下降更多且存在明显的剂量关系(表1)，这说明生物炭可能对蚯蚓本身产生了不利影响。生物炭是有机物质高温热解后的产物，其有效养分含量低、稳定性高、难分解等特点使其对蚯蚓适口性较差，进而在短期培养中表现出对蚯蚓的抑制作用[25]。利用2-D培养试验，TOPOLIANTZ 等[26]亦发现蚯蚓在土壤中通过吞食创造了14.6 cm3的蚯蚓洞穴，而在混有生物炭的土壤中蚯蚓仅创造了1.7 cm3的蚯蚓洞穴。笔者研究中生物炭与土壤进行了充分混合，蚯蚓别无选择只能取食包含生物炭的土壤，这对蚯蚓生物量及活性造成了不可避免的影响[20]。

笔者研究结果显示，蚯蚓的存在导致土壤N2O排放提升约10～15倍(图1)，土壤CO2排放提升约2～3倍(图1)，这与LUBBERS等[12]的研究结果一致。虽然蚯蚓自身仅产生很少的N2O，但可通过促进土壤有机物质分解和矿化，增加硝化-反硝化底物来刺激N2O产生[15]。这一观点可从图2中接种蚯蚓处理无机氮含量均高于对应的无蚯蚓处理这一结果得以证实。蚯蚓自身呼吸是蚯蚓活动增加土壤CO2释放量的重要部分[27]，其生命活动提供的易利用养分亦能通过刺激微生物活性而促进土壤CO2排放。

已有很多研究证实，由于生物炭普遍呈碱性，且具有多孔结构，因此施用生物炭能够通过改善酸性土壤pH值，以及通过吸附土壤中铵态氮来减少硝化作用底物，进而抑制土壤N2O排放[28]。笔者研究得到了类似结果，即施用生物炭提高了土壤pH(图2)，降低了土壤无机氮含量(图2)，降低了土壤N2O排放。就无蚯蚓处理而言，N2O累积排放量在SL和SH处理间并无显著差异，这可能归结于低剂量生物炭添加已获得了较好的土壤无机氮吸附效果。蚯蚓与生物炭对土壤N2O累积排放量的影响存在明显的交互作用(表2)，且蚯蚓存在时不同量生物碳施用下的土壤N2O累积排放量均存在显著差异(图1)。DRAKE等[29]认为，蚯蚓肠道是一个特殊的微环境，肠道内的厌氧环境，适宜的pH和湿度，充足的有机物质和硝酸盐、亚硝酸盐供应等，均能有效促进肠道内反硝化微生物的生长。因此，来源于蚯蚓肠道的微生物随蚓粪进入土壤，并和蚓体分泌的黏液形成有利于反硝化作用的土壤环境，是导致新鲜蚓粪成为N2O产生热点的原因[13]。若生物炭混入土壤并被蚯蚓吞食，此时生物炭的多孔结构就让生物炭充当了一个氧气库的作用，通过改变蚯蚓肠道微环境的氧气状况而改变蚯蚓对土壤N2O排放的影响[30]。当混入土壤的生物炭较多时，被蚯蚓吞食进入肠道的生物炭也就更多，对蚯蚓肠道环境的作用也就更强。这可能是导致不同剂量生物炭施用对蚯蚓作用下土壤N2O排放的抑制效应产生差异的主要原因。而对于蚯蚓作用下CO2累积排放量来说，则主要集中在蚯蚓自身活性的改变上，因此仅在高剂量生物炭施用与无生物炭施用之间存在显著差异。

作为“土壤生态系统的工程师”，蚯蚓在土壤中既扮演有利的角色，如促进土壤形成、促进作物生长等，也有不利的一面，如增加土壤N2O和CO2排放。笔者研究发现，施加生物炭可抑制蚯蚓诱导的土壤温室气体排放，但与此同时对蚯蚓本身不利的影响也削弱了蚯蚓的生态系统功能。若要达到两者的平衡，或许可以从生物炭施用量上入手，如在低剂量添加条件下即可显著降低蚯蚓存在时的N2O排放(图1)。此外，生物炭本身的性质，如元素组成、孔隙结构特征等，亦是影响其温室气体减排效果的关键因子[31]。未来可以考虑采用不同类型生物炭开展更多研究，以进一步明确生物炭-蚯蚓互作对土壤温室气体排放的影响。

4 结论

(1)无论是否添加生物炭，与无蚯蚓处理相比，接种蚯蚓(Amynthasheterochaetus)均显著促进土壤N2O和CO2的排放。

(2)施用生物炭显著降低了蚯蚓诱导的土壤N2O 排放量，且施用量越大，效果越明显。

(3)仅施用高剂量生物炭能显著降低蚯蚓诱导的土壤CO2排放量。