珍珠龙胆石斑鱼血细胞发生的研究

汤绮桐，曹伏君，叶 宁

(广东海洋大学 水产学院，广东 湛江 524088)

珍珠龙胆石斑鱼(Epinepheluslanceolatus♂×E.fuscoguttatus♀)，又名龙虎斑或珍珠斑，是雄性龙胆石斑鱼与雌性老虎斑杂交成的新品种石斑鱼。珍珠龙胆石斑鱼的肉质滑嫩鲜美，营养丰富，而且成长快速，个体大的体长可达50 cm。珍珠龙胆石斑鱼具有食性广、抗病能力强等优点。得益于海南育种研究人员的多年研究，珍珠龙胆石斑鱼已经可以进行规模化养殖[1]。

目前，国内对于珍珠龙胆石斑鱼的研究主要集中于养殖方式、生长发育情况、药物等方面[2]，而对于其造血器官中的血细胞发生的研究相对较少。笔者对珍珠龙胆石斑鱼血细胞的发生进行详细研究，以期为鱼类血细胞发生的研究提供更多的参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

试验珍珠龙胆石斑鱼购自湛江市荣成养殖场，共10尾，雌雄各半。购回后在室内养殖池内暂养1 d(曝气24 h的自来水，室温，充气泵增氧，不投饵料)。试验时选取健康状况良好、身体无外伤的个体。

1.2 方法

1.2.1 造血器官印迹片、涂片制备

拭净鱼体表，剖开胸腹腔，将鱼的头肾、体肾、脾脏取出，在0.65%鱼用生理盐水中洗去表面血渍，然后用滤纸吸干，用刀片将每个器官分别作横切、纵切4个断面，每个断面在洁净载玻片上轻轻印5个印迹面。每尾鱼各器官各作印迹片20张，待干后，瑞氏染液染色10 min，加入磷酸缓冲液浸泡10 min，用清水冲洗，晾干。中性树脂封片。各组织分别剪碎作涂片10张。

1.2.2 血细胞计数与测量

分别取头肾、体肾和脾脏各10张以上印片、涂片，每张印片、涂片随机取5个视野，对各细胞系按其发生的不同阶段进行形态描述，分类计数并计算百分比值。用Olympus BX51显微镜油镜观察，并选择较好的图片，在1392×1040像素下拍照，标尺为200 μm；任选各型细胞各20个进行长、短径测定，作统计处理。

1.2.3 血细胞发育阶段的划分

参照《野生动物血液细胞学图谱》[3]的标准划分。

2 结 果

2.1 各类血细胞的发育过程

鱼类血细胞的发育一般会被划分为原始、幼稚、成熟3个阶段[4-5]。

2.1.1 红细胞系

原红细胞(图1a)：原红细胞的胞体呈圆形或椭圆形，细胞体比较大，细胞质比较少，被染成深蓝色。原红细胞的细胞核很大，占细胞的大部分，位于细胞的中央或略偏于细胞的一侧，核膜明显，核仁清晰可见,细胞核内染色质被染成紫红色，呈粗粒状。细胞核周围存在颜色较浅的浅红色环核带区。

幼红细胞(图1b～h)：细胞呈圆形或椭圆形，早幼红细胞的细胞质颜色逐渐变浅，呈浅蓝色或灰蓝色，细胞质周围有一条狭窄的深蓝色环带区。细胞核内染色质被染成紫红色，核仁逐渐消失。晚幼红细胞呈圆形或椭圆形，细胞质染成桔黄色或桔红色，细胞核更致密。

红细胞(图1i～j)：红细胞呈圆形或椭圆形，细胞质被染成桔红色。细胞体外表面光滑，无胞突，细胞核位于细胞的中央，或稍微偏于细胞的一侧，呈圆形或椭圆形，染色质致密成块，呈深紫红色，沿细胞核的周围或者中央均匀分布。衰老红细胞呈不规则圆形或椭圆形，此时的体积与正常红细胞相比，体积更小，细胞核更浓缩，染色更深。

图1 珍珠龙胆石斑鱼红细胞系Fig.1 Erythroid lineage in grouper hybrid E.lanceolatus ♂ × E.fuscoguttatus ♀a.原红细胞;b.早幼红细胞—早期;c.早幼红细胞—晚期;d.晚幼红细胞;e～h.早期早幼红细胞的有丝分裂相.i.红细胞;j.衰老红细胞.a.proerythroblast;b.basophilic erythroblast in early stage;c.basophilic erythroblast in late stage;d.later acidophilic erythroblast;e—h.mitotic division of basophilic erythroblast in early stage;i.erythrocyte;j.aging erythrocyte.

2.1.2 粒细胞系

原粒细胞(图2a):原粒细胞的细胞体呈圆形或卵圆形，细胞质量少，染成蓝色，着色均匀，透明无颗粒。核质比大，约占细胞的2/3～4/5。原粒细胞的细胞核呈圆形或椭圆形，位于细胞的中央，或稍微偏于细胞的一侧，细胞核染色质被染成浅紫红色，呈细沙粒状，均匀分布在细胞核内，核仁被染成淡蓝色，明显可见。

早幼粒细胞(图2b):细胞体呈圆形或卵圆形，细胞质呈浅蓝色，细胞质中有浅紫红色嗜天青颗粒出现。早幼粒细胞的细胞核呈椭圆形，偏于细胞的一侧，约占整个细胞的1/3～1/2。早幼粒细胞的细胞核内染色质较深，核仁不清晰，或者完全消失。

中幼粒细胞：从中幼粒细胞开始，细胞内的嗜天青颗粒的数量逐渐减少，特殊性颗粒含量增多，可根据特殊性颗粒明显分辨出两种不同的粒细胞。

(1)中性中幼粒细胞(图2c)：细胞呈圆形或椭圆形，核质比小。中性中幼粒细胞的细胞核呈圆形或椭圆形，约占整个细胞的1/3～1/2，常偏于细胞的一侧，细胞核内染色质浓聚，核仁消失不见。胞质含量较多，被染成浅蓝色或浅蓝微红色，细胞质内有许多特异性颗粒，颗粒的着色很浅，经过染色显示为微黄色或者淡粉红色。

(2)嗜酸性中幼粒细胞(图2d)：嗜酸性中幼粒细胞的体积比中性中幼粒细胞小，细胞呈圆形或近圆形，核质比大，约为1/2，细胞核常常偏于细胞的一侧，染色质被染成深紫红色。嗜酸性中幼粒细胞的细胞质比早幼粒细胞的细胞质染色更浅，显示淡蓝色，质里含有许多红色嗜酸性颗粒，颗粒大量分布，导致整个细胞呈红蓝过渡色或红色。

晚幼粒细胞:

(1)中性晚幼粒细胞(图2e)：与中幼粒细胞相比，中性晚幼粒细胞的体积更小，胞体呈圆形或椭圆形，核质比大，约为1/2，中性晚幼粒细胞的细胞核呈椭圆形，或核的一侧凹陷至肾形，细胞核内染色质致密成块，没有核仁。中性晚幼粒细胞的细胞质呈浅蓝或浅粉红色，细胞质里含有大量嗜中性颗粒，颗粒显淡黄色或无色。

(2)嗜酸性晚幼粒细胞(图2f)：嗜酸性晚幼粒细胞胞体呈圆形或近圆形，与嗜酸性中幼粒细胞相比，嗜酸性晚幼粒细胞的体积更小，细胞核呈圆形或椭圆形，核质比较小，小于细胞体积的1/2，细胞核位于细胞的一侧，细胞核内的染色质浓缩，被染成深紫红色，细胞质被染成红色，整个细胞质中充满特异性嗜酸性颗粒。

成熟粒细胞:

(1)中性粒细胞(图2g～h)：细胞呈圆形或椭圆形，核质比小，细胞核的体积小于1/3，细胞核形状多样，呈椭圆形、凹陷成肾形、杆状或者分2～5叶，细胞核常常位于细胞的一侧，或者与细胞质膜相切，细胞核内的染色质浓缩，呈暗紫红色，无核仁，中性粒细胞的细胞质被染成浅粉红色，含有大量特异性的嗜中性颗粒。

(2)嗜酸性粒细胞(图2i)：嗜酸性粒细胞和嗜酸性晚幼粒细胞的细胞形态类似，但与嗜酸性晚幼粒细胞相比，嗜酸性粒细胞的细胞体积更小，细胞核更加偏位。

图2 珍珠龙胆石斑鱼粒细胞系Fig.2 Granuloid lineages in grouper hybrid E.lanceolatus ♂ × E.fuscoguttatus ♀a.原粒细胞;b.早幼粒细胞;c.中性中幼粒细胞;d.嗜酸性中幼粒细胞;e.中性晚幼粒细胞;f.嗜酸性晚幼粒细胞;g.中性粒细胞;h.中性粒细胞;i.嗜酸性粒细胞.a.progranuloblast;b.young progranulocyte;c.neutrophilic progranulocyte;d.eosinophilic progranulocyte;e.neutrophilicmetagranulocyte;f.eosinophilic metagranulocyte;g.neutrophilic granulocyte;h.neutrophilic granulocyte;i.eosinophilic granulocyte.

2.1.3 单核细胞系

原单核细胞(图3a):细胞体积很大，呈圆形、椭圆形或不规则形，细胞质呈浅蓝色。核质比较大，约占1/2以上，细胞核呈不规则椭圆形，常偏于细胞的一侧，原单核细胞核内染色质是所有原血细胞中最细的，染成浅紫红色，呈细丝网状，走向与细胞核的长轴平行，核仁明显可见。

幼单核细胞(图3b):细胞呈圆形或不规则椭圆形，与原单核细胞相比，体积更小。幼单核细胞的细胞质呈灰蓝色，可以看到有一些大小不一的空泡，有的胞浆内可以看见少量细小嗜天青颗粒出现。细胞核呈椭圆形或不规则形，核质比较大，约占1/2，细胞核内染色质呈细丝网状，核仁模糊不清，至逐渐消失。

单核细胞(图3c):细胞呈圆形或椭圆形，细胞质被染成浅蓝色，量多。单核细胞的细胞核呈不规则圆形或椭圆形，核质比较大，约占1/3～1/2，细胞核内的染色质松散，呈浅紫红色。细胞质里可以看到有细小嗜天青颗粒和一些大小不一的空泡。

图3 珍珠龙胆石斑鱼单核细胞系Fig.3 Monocytoid lineages in grouper hybrid E.lanceolatus ♂ × E.fuscoguttatus ♀a.原单核细胞;b.幼单核细胞;c.单核细胞;d.巨噬细胞—早期;e.巨噬细胞;f.巨噬细胞.a.promonoblast;b.young promonocyte;c.monocyte;d.macrophage in early stage;e.macrophage;f.macrophage.

巨噬细胞(图3d～f):细胞体积大，细胞质中许多空泡，巨噬细胞的细胞核染色质着色浅，核边界不清晰，靠近细胞边缘，可见有吞噬的无核红细胞(胞质小体)及其他吞噬物在细胞质内。

2.1.4 淋巴细胞系

原淋巴细胞(图4a):细胞体呈圆形，细胞质量少，染成深蓝色。幼淋巴细胞的细胞核很大，呈圆形或椭圆形，细胞核一般位于细胞中央，有时会有偏位，染色质被染成紫红色，呈粗网状，核仁清晰，细胞核与细胞质的界限十分明显。细胞核周围的细胞质染色略淡，形成颜色较浅的核周淡染带。细胞膜比较平整，偶尔有胞突。

幼淋巴细胞(图4b):细胞体呈圆形或近圆形，可见钝形胞突，幼淋巴细胞的细胞质含量很少，染成蓝色或浅蓝色，有嗜天青颗粒出现。幼淋巴细胞的细胞核呈圆形，或稍有凹陷，染色质被染成紫红色，呈粗网状，核仁不清晰，或消失。

淋巴细胞(图4c～g):淋巴细胞根据大小的不同可以分为小淋巴细胞、中淋巴细胞和大淋巴细胞。

图4 珍珠龙胆石斑鱼单核细胞系Fig.4 Lymphoid lineages in grouper hybrid E.lanceolatus ♂ × E.fuscoguttatus ♀a.原淋巴细胞;b.幼淋巴细胞;c.大淋巴细胞;d.中淋巴细胞;e.小淋巴细胞;f.小淋巴细胞;g.分裂的淋巴细胞.a.lymphoblast;b.prolymphocyte;c.large lymphocyte;d.medium lymphocyte;e.small lymphocyte;f.small lymphocyte;g.mitotic division of lymphocyte.

小淋巴细胞的个体很小，细胞体呈圆形或类圆形，细胞质被染成浅蓝色，细胞质的含量十分少，常常可以见到较短的胞突，或细胞质凹陷，细胞核染成暗紫红色，染色质致密成块，无核仁。

大淋巴细胞个体比较大，细胞体呈类圆形，有胞突，细胞质染成蓝色或浅蓝色，细胞质的含量比小淋巴细胞的多，细胞核呈圆形或肾形，与小淋巴细胞相比，大淋巴细胞染色质更细而松散，染色呈紫红色，比小淋巴细胞稍淡。

2.1.5 其他细胞

血栓细胞(图5a):细胞体积比淋巴细胞的体积小，呈圆形、椭圆形或纺锤形，核质比大。血栓细胞的细胞核呈圆形或椭圆形，被染成暗紫红色，与淋巴细胞的细胞核相比，染色更深，细胞质十分少或围绕细胞核零星分布，有的血栓细胞甚至成裸核状，细胞质边界模糊，呈浅蓝色。

网状细胞(图5b):细胞胞体很大，呈类圆形，不规则，在细胞膜上可以看到有许多突起的伪足。网状细胞的细胞核大，呈椭圆形或类圆形，染色质呈细沙粒状。细胞质呈浅蓝色，染色不均匀，常可见淋巴细胞、粒细胞、血栓细胞等细胞镶嵌在网状细胞的细胞质边缘。

图5 珍珠龙胆石斑鱼其他血细胞Fig.5 Other cells in grouper hybrid E.lanceolatus ♂ × E.fuscoguttatus ♀a.血栓细胞;b.网状细胞.a.thrombocyte;b.reticulocyte.

2.2 血细胞的计数与测量

2.2.1 血细胞计数

在头肾和体肾的印片、涂片上可以观察到原红细胞，而在脾脏中未观察到原红细胞，说明头肾和体肾是珍珠龙胆石斑鱼红细胞的主要发生器官。同样，在头肾和体肾内可以观察到原粒细胞，而在脾脏涂片上未观察到原粒细胞，说明头肾和体肾可能是珍珠龙胆石斑鱼粒细胞的主要发生器官，其他两种原始细胞(原单核细胞、原淋巴细胞)均可在头肾、体肾、脾脏中观察到，因此推断头肾、体肾、脾脏是其他两种血细胞(原单核细胞、原淋巴细胞)发生的主要场所。因此，珍珠龙胆石斑鱼最主要造血器官是头肾(表1)。

2.2.2 血细胞测量

原红细胞和幼红细胞的细胞体大小变化不大，细胞从圆形(类圆形)逐渐变成椭圆形(近椭圆形)，原红细胞的细胞体积约为红细胞的2倍，原红细胞的细胞核体积约为红细胞细胞核的4.5倍，基本都呈圆形(类圆形)。粒细胞系中，同一时期的中性粒细胞均比同时期的嗜酸性粒细胞的细胞体、细胞核大。成熟的嗜酸性粒细胞体积相对于粒细胞系整体细胞体积明显偏小，与成熟的中性粒细胞相比，体积相差较大；成熟的中性粒细胞的体积均比中性晚幼粒细胞、中性中幼粒细胞、早幼粒细胞大，原单核细胞是所有原血细胞中体积最大的。原淋巴细胞是所有原血细胞中体积最小的。大淋巴细胞与小淋巴细胞的体积差别较大，大淋巴细胞的细胞体积约是小淋巴细胞的3倍，细胞核体积约是小淋巴细胞的1.5倍。巨噬细胞是珍珠龙胆石斑鱼的血细胞中体积最大的细胞；血栓细胞是体积最小的细胞(表1)。

表1 珍珠龙胆石斑鱼血细胞的计数与测量Tab.1 Count and measurement of blood cells in grouper hybrid E.lanceolatus ♂ × E.fuscoguttatus ♀

(续表1)

3 讨 论

3.1 珍珠龙胆石斑鱼血细胞的发育及特点

在红细胞系的发育过程中，细胞体逐渐变小，细胞质颜色逐渐变浅，细胞核逐渐变小，细胞核染色质的颜色逐渐变深，最后致密成块。与兴国红鲤(Cyprinuscarpio)[4]、点带石斑鱼(E.malabaricus)[6]、淡水石斑鱼(Cichlasomamanaguense)[7]红细胞的发育过程中细胞体由大变小,再变大不同。与长吻(Leiocassislongirostris)[8]细胞体积由大到小，由小到大再变小的“两大两小”发育过程不同。

粒细胞系发育过程中，其中性粒细胞细胞体的体积先由大变小，再变大，细胞核逐渐变小，嗜酸性粒细胞的细胞体积逐渐变小，细胞核逐渐变小。这与兴国红鲤[4]、斜带石斑鱼(E.coioides)[9]中性粒细胞先变大再变小不同。与淡水石斑鱼[7]、长吻[8]、长鳍裸颊鲷(Lethrinuserythropterus)[10]中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的体积逐渐变小略有不同。与点带石斑鱼[6]的中性粒细胞先由大变小，再由小变大，再变小不同。

单核细胞系发育中，细胞逐渐变小，细胞核也逐渐变小。这与点带石斑鱼[6]的先变小再变大不同。与淡水石斑鱼[7]的单核细胞在发育的过程中细胞体逐渐变小相同。与斜带石斑鱼[9]的先由大变小，再由小变大不同。

淋巴细胞系发育中，细胞逐渐变小(大淋巴细胞除外)，细胞核也逐渐变小(大淋巴细胞除外)。这与点带石斑鱼[6]、斜带石斑鱼[9]的淋巴细胞的逐渐变小的过程相同。与淡水石斑鱼[7]的先变大再变小不同。

各个时期的核仁均从有至无，与其他鱼类相同。

鱼类血细胞组成的特点与其发育情况、分类地位及生活习性之间的相互联系还有待进一步研究。

珍珠龙胆石斑鱼的血细胞的发育与部分的鱼类血细胞的发育不同，特别是红细胞和粒细胞的发育，可能是因为细胞分类时没有对幼红细胞进行进一步细分，忽略了晚期的幼红细胞有丝分裂细胞体积变大的过程；也可能是由不同鱼种间差异导致。

3.2 石斑鱼血细胞的体积大小

对比其他鱼类，无论是石斑鱼还是其他非石斑鱼，如点带石斑鱼[6]、淡水石斑鱼[7]、长吻[8]、斜带石斑鱼[9]、长鳍裸颊鲷[10]、花尾胡椒鲷(Plectorhinchuscinctus)[11]、大弹涂鱼(Boleophthalmuspectinirostris)[12]等，珍珠龙胆石斑鱼血细胞的体积明显比其他鱼类的血细胞的体积大，基本是其他鱼类的2倍。因为珍珠龙胆石斑鱼是新种的杂交鱼，具有杂交优势[13-14]，细胞体积比较大。

观察发现，珍珠龙胆石斑鱼的中性成熟粒细胞的细胞体积远比嗜酸性成熟粒细胞的大，其他研究中暂未发现类似的情况。这种情况为首次发现，可能是变异或其他原因导致，但未深入研究。两种粒细胞的发育过程中体积变化也不相同，可能与两种粒细胞的功能有关。

在体肾中还发现了巨大的巨噬细胞和网状细胞，但未发现其发育过程。有部分学者[12]认为巨噬细胞来源于单核细胞，但在不同的鱼类中，巨噬细胞被观察到所处器官不一致，且暂未有直接证据显示巨噬细胞由单核细胞发育而来，因此需进一步研究。

3.3 血细胞发生的场所

头肾和体肾是珍珠龙胆石斑鱼红细胞、粒细胞的主要发生器官。头肾、体肾、脾脏是原单核细胞、原淋巴细胞发生的主要场所。因此，珍珠龙胆石斑鱼最主要造血器官是头肾。上述结论与点带石斑鱼[6]、斜带石斑鱼[9]红细胞的主要发生器官可能是头肾，其他各类血细胞发生的主要场所为头肾和体肾的结论一致；与淡水石斑鱼[7]、长鳍裸颊鲷[10]的情况相似；与长吻[8]主要的造血器官是头肾、体肾和脾脏，红细胞、粒细胞和淋巴细胞主要在肾脏和头肾中发生的结论相似；与花尾胡椒鲷[11]的主要造血器官是头肾，脾脏次之，体肾又次之的结论不同；与大弹涂鱼[12]的红细胞系和单核细胞系的发育主要在体肾，肾脏和脾脏中均存在淋巴细胞系和粒细胞系的发育的结论不一致。可以通过各个器官组织不同类型血细胞的原始型和未成熟型的数量和占血细胞总数的比例来分析血细胞发生的场所[15]。在头肾涂片中，可以观察到大量各类细胞的原始细胞和幼稚细胞，因此，头肾是珍珠龙胆石斑鱼的主要发生器官。

可以推测，珍珠龙胆石斑鱼血细胞发生的情况、主要造血器官与其他石斑鱼血细胞发生的情况相似，与其他非石斑鱼的鱼类略有不同，大体上符合硬骨鱼的血细胞发生、发育特点。