外周血PCA3基因mRNA检测诊断前列腺癌临床应用价值

汤山松 杨 霞

四川省资阳市人民医院肿瘤科 641300

目前，PC常用的筛查方法为血清前列腺特异抗原检查，但其体内水平个体差异较大。因此确定其诊断PC的cutt-off值较为困难且临床应用特异性较低。PCA3为新近鉴定的在PC患者中特异高表达的癌基因[1]。有研究显示，与正常人群相比，PCA3 mRNA在PC患者中表达水平呈现显著升高[2-3]。因此，本研究探讨外周血中PCA3 mRNA水平在PC诊断中的可行性，及其作为生物标志物的应用价值。

1 对象与方法

1.1 对象来源 选取2016年2月—2020年4月我院收治的确诊PC患者24例(病例组)和良性前列腺增生(BPH)40例及泌尿系结石患者13例(对照组)作为研究对象。患者纳入标准：患者年龄>50周岁；获取患者标本前均需要签署知情同意书；病理学或细胞学证实PC、BPH或泌尿系结石；PC患者为初诊且既往未接受过治疗。排除标准：患者无细胞学或病理学诊断；合并性传播疾病；合并有其他系统恶性肿瘤；HIV阳性患者均予以排除。

1.2 试剂与仪器 Trizol试剂(美国Invitrogen公司)，逆转录酶MMLV(购自大连宝生物，TAKARA公司)，核酶抑制剂RNAsin，dNTP，DEPC水(购自Tiangen公司)，PCR引物合成(由华大基因完成)，Taq酶，EX TaqTMR-PCR(购自大连宝生物，TAKARA公司)，实时荧光定量PCR仪(购自ABI公司)， 高速离心机(购自美国Beckman公司)，紫外凝胶成像系统(购自美国BIO-RAD公司)。

1.3 标本采集与处理 患者确诊后，抽取静脉血3ml，置入乙二胺四乙酸抗凝的采血管中，并向采血管中加入Trizol试剂吹打混匀，-80℃保存备用。

1.4 实验方法

1.4.1 总RNA提取：Trizol法提取总RNA[4]，取预先收集的外周血0.5ml置于无酶EP管中，向EP管中加入1ml Trizol，涡旋30s，26℃静止6min，低温高速离心(12 000r/min)，离心10min。吸取上层无色澄清液体置入另一无酶EP管中并加入200μl氯仿，剧烈震荡10s，然后26℃放置5min，低温高速离心(12 000r/min)，离心10min。转移上次液体至另一离心管中并加入600μl异丙醇，充分震荡后静置10min。后低温高速离心(12 000r/min)，离心10min。然后弃去上层清夜，保留EP管地步沉淀并加入1 000μl 75%的乙醇，充分混匀后8 000r/min，低温离心4min。弃去上清，晾干后置于-80℃冰箱中保存。

1.4.2 实时荧光定量PCR反应：根据ABIPRISM 7900HT Fast Real-time PCR 仪器说明进行操作。PCA3基因上游引物5’-AGAAGCTGG CATCAGAAAAA-3’下游引物3’-TCCTGCCCATCCTTTAAGG-5’，反应体系见表1。

表1 PCA3基因Real-time PCR反应体系

1.5 统计学方法 PCA3 mRNA表达量计算，ΔCT=CTpca3-CTβ-actinPCA3mRNA相对表达量=2-ΔCT×10。 Stata 12.0统计软件绘制ROC曲线，并根据敏感性和特异性的最佳组合判断cutt-off值，并给出相应的该临界值下诊断PC的敏感性和特异性，计算AUC，检验效能为α=0.05。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCA3 mRNA表达水平 PC、BPH及泌尿系结石患者PCA3 mRNA水平分别为62.7±29.8、8.9±6.4和4.1±2.2，PC组显著高于其他两组患者(P<0.05)，见图1。

图1 三组患者1PCA3基因mRNA表达水平比较

2.2 PCA3mRNA检测诊断前列腺癌的价值 根据贝叶斯定理绘制ROC曲线并计算曲线下面积AUC=0.94，确定cut-off值为16.2，该cut-off值下诊断PC的敏感性为78.8%，特异性为95.8%，见图2。

图2 PCA3基因诊断前列腺癌的ROC曲线图

3 讨论

在西方国家PC的发病率较高，2013年美国PC新发病例为238 590例，PC发病率约占全身恶性肿瘤的28%，为发病率最高的恶性肿瘤，死亡人数为29 720例，占恶性肿瘤死亡人数的10%，为第二位[5]。与西方国家相比我国等东亚人群PC的发病率较低，但尚无确切流行病学数据[6]。临床上，对PC高危人群进行筛查，早期发现肿瘤性病变是提高PC预后的重要方法[7]。前列腺解剖位置隐秘，临床查体及影像学检查等不易发现早期病变。近年来的研究显示PCA3在PC患者呈现高表达，而在良性前列腺增生及正常人群中表达水平较低[8-9]，因此，PCA3有可能成为早期筛查PC的肿瘤标志物。PCA3基因是由约翰霍普金斯医院的Baltimore和Nijmegen 共同发现的，该基因定位于人9号染色体21-22区全长约25kb，该基因由4个exon和3个introns组成[10]。国外文献报道，PCA3基因mRNA在PC组织中拷贝数显著上升[2]，同时亦有文献报道，PC患者体液标本同样可以检测到拷贝数增加的mRNA水平[11]。这样的结果提示，PCA3基因有可能成为诊断PC的生物学标志物。PCA3基因在PC与BPH患者体内呈现差异性表达，为其成为诊断PC的生物学标志物提供了可能；其次，在外周血或尿液中这种差异表达仍能检测到，为采用微创或无创的方法筛查PC提供了方便条件。

国内刘龙亚等人[12]采用qPCR方法检测PC及BPH患者外周血及前列腺按摩液中的PCA3基因表达水平，研究结果提示，PC患者外周血及前列腺液中PCA3表达水平显著高于BPH患者，采用PCA3作为诊断标准，其诊断PC的敏感性为86.5%。在本研究中，PC组患者PCA3 mRNA表达水平显著高于其他两组患者(P<0.05)。根据贝叶斯定理计算的ROC曲线下面积AUC=0.94，cut-off值为16.2，该cut-off值下诊断PC的敏感性为78.8%，特异性为95.8%。提示PCA3基因mRNA检测可作为PC患者有效诊断方法。

综上所述，检测PC高危人群外周血中PCA3 mRNA表达为筛查PC提供了可行性方法，其诊断的敏感性和特异性均较高。但本研究纳入患者例数较少，且为单中心的临床研究，同时各组人群纳入及实验过程中均未采用盲法，因而实验结果可能受到信息偏倚等因素的影响。因此，在实验条件、经济条件允许的大型医疗中心应进一步进行多中心的前瞻性临床研究，为PCA3检测作为PC筛查的肿瘤标志物提供更为充分的临床依据。