四川烤烟赤星病的生物学特性及药剂筛选

李茂业 闫芳芳 刘苏 谢云波 徐传涛 李斌 江连强 何佶弦 刘明科 杨洋

摘  要：为明确四川烤烟赤星病发生规律和生物学特性并筛选高效防治药剂，连续3年在四川省泸州市、凉山州、攀枝花市、广元市、宜宾市等5个主要植烟区对烟草赤星病发生情况进行调查，并在烟叶成熟期采集典型患病烟叶进行病原菌分离培养，通过宏观形态学、显微形态学及分子生物学鉴定其种类并测定菌落生长速率和萌发率，同时在烟田开展烟草赤星病高效防治药剂筛选。结果表明，5个烟区采集的赤星病样均属于链格孢属（Alternaria spp.）真菌，各烟区所采集分离的赤星病菌在SDAY培养基上菌落直径、产孢量和萌发率差异均不显著。5个烟区均发生烟草赤星病，整体发病规律为：每年6月底至9月初，烟田病情指数随着时间的推移逐渐增加，每年8月份，5个植烟区烟草赤星病病情指数显著高于7月份并趋于峰值。10%苯醚甲环唑水分散粒剂和40%菌核净可湿性粉剂对烟草赤星病均有较好的防治效果（防效均大于60%）。

关键词：烟草赤星病菌;发生规律;生物学特性;高效药剂

Abstract： In order to determine the periodic occurrences， biological characteristics and high effective fungicides of tobacco brown spot disease in Sichuan Province， systematic investigation was carried out to study the occurrence of brown spot of tobacco for three consecutive years in 5 major planting areas of Sichuan Province including Luzhou， Liangshan， Panzhihua， Guangyuan and Yibin. Tobacco samples with typical symptoms of brown spot were collected at maturity. To identify the causal species of the disease， colonies isolated from brown spot-infected tobacco were studied using macromorphology， micromorphology and molecular biology methods and growth rate and germination rate determined. At the same time， the screening of high efficiency emergency chemicals for brown spot of tobacco was conducted in tobacco fields. The results showed that the causal pathogens identified from tobacco samples with typical symptoms of brown spot from the 5 major planting areas of Sichuan Province were all Alternaria spp. There were no significant difference in colony diameter， spore production and germination rate among the isolates of Alternaria spp. on SDAY media. The disease index of Alternaria spp. increased gradually with time from the end of June to September every year in the 5 growing areas of tobacco. In August of every year， the disease index of Alternaria spp. in the 5 growing areas of tobacco was significantly higher than that in July and reached a peak. 10% Difenoconazole water dispersible granule and 40% mycelium net wettable powder had good control effects to control Alternaria spp of more than 60% which was stable among the 5 growing areas.

Keywords： tobacco brown spot disease; periodic occurrences; biological characteristics; high efficiency pesticides

烟草真菌侵染性病害是烟草上的重要病害，给烟农造成巨大经济损失[1]。由链格孢菌引起的烟草赤星病是主要真菌性病害，该病害不仅侵染烟草叶片，还侵染烟株茎、花梗等部位，其发生特点为潜育期较短、传播速度快[1-2]。有学者统计，烟草赤星病在中国每年发生的面积达数十万公顷，造成的经济损失达上亿元人民币，烟草赤星病防治成为目前烟草生产中的重要任务[3-4]。

烟草赤星病以菌丝越冬，为弱寄生菌，在寄主和环境适宜时，可以多次侵染致使其爆发流行。赤星病爆发流行与湿度、温度等环境因素和寄主本身抗性及生育期具有相关性。四川省为我国烤烟的主要产地之一，目前每年种植面积达8万hm2左右。四川省各植烟区生态类型不同，每年各植烟区均报道有赤星病的发生，一般在烟草生长成熟期病株率达40%以上，严重制约了省内烤烟的可持续发展。目前，有关四川省不同生态类型植煙区赤星病的发生分布特征、生物学特性及高效防治药剂的报道较少。本研究通过调查四川省不同植烟区赤星病发生分布特征，采集发病烟叶并进行分子鉴定，观察赤星病菌生物学特性，同时针对不同植烟区筛选高效防治药剂，以期为赤星病的防治提供理论和技术支持。

1  材料与方法

1.1  赤星病调查与样品采集

试验于2017—2019年6—9月开展，在四川省泸州市、凉山州、攀枝花市、广元市、宜宾市5个主要植烟区对烟草赤星病发生情况进行定点系统调查，每个烟区选择具有代表性的3个田块，每个田块选择100株烟，每周调查1次。在烟叶成熟时采集病斑呈圆形或近圆形、具有显著褐色同心轮纹并附有黑色霉层的赤星病典型症状的烟叶样品，同时记录采集时间和发病率等信息。

1.2  赤星病病原分离纯化和分子鉴定

将赤星病典型症状烟叶用无菌水洗去表面异物，用无菌剪刀剪下病斑组织，在无菌操作台上， 75%酒精浸泡消毒2～3 s，0.1%升汞溶液浸泡消毒2～3 min，无菌水冲洗3次，吸干病斑组织表面水分，置于SDAY培养基上培养[（26±1）℃，每天光照16 h]，至菌丝长出，用无菌接菌针挑取菌丝在新的SDAY培养基平板上纯化，直至获得单个菌落。

将获得的单孢菌株在SDAY培养基上培养4～6 d后，利用基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA;采用通用引物，上游引物PCRA-F：CTCCGAATTCTACGGACGCAAGCCGGAAGGAACC，下游引物PCRA-R：GTCGCTAACCTTCTG CTTCAGGAGCAGACCGCTG，以基因组DNA模板进行PCR扩增，将扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序，将测得的实验菌株序列结果在GenBank数据库用BLAST进行序列比对，分析其分类地位。

1.3  病原菌生物学特性测定

将采集自四川省各市州的烟草赤星病菌株接至SDAY培养基上，在人工气候培养箱中培养，每天利用直尺采用十字交叉法测量各菌株生长直径，连续测量5 d。当培养至第10天时采用血球计数板测量菌落单位面积的产孢量。用无菌水将孢子稀释为1.0×106 cfu/mL的悬浮液，用移液枪吸取15 ?L滴在含SDAY固体培养基的载玻片上，将载玻片置于（25±1） ℃的无菌环境下培养18 h后，用显微镜随机镜检5个不同视野，记录孢子萌发率。

1.4  田间药剂筛选

于2019年6月25日在各烟区进行药剂筛选试验。设5个药剂处理，以清水作为对照（表1）。每处理设3次重复，每个重复100 m2。发病初期，每10 d施药1次，连续施药3次。分别于第1次施药前1 d、第1次施药后7 d和第3次施药后7 d进行3次调查。每处理定点调查小区中间的100株，外围烟株视为保护行。按病情分级标准，记录并计算各处理组烟株发病率、病情指数和相对防治效果。

1.5  数据统计与分析

菌株生长速率、萌发率、药剂防效等采用Excel 2019软件进行统计，DPS进行方差分析，Duncans新复极差法进行多重比较。差异显著性水平设为p<0.05。

2  结  果

2.1  赤星病菌株的采集分离及生物学性状

由表2看出，从四川攀枝花、凉山、泸州、宜宾、广元5个烟区分离出的赤星病菌株表现出链格孢属真菌的典型特征，菌丝在SDAY培养基上生长初期为淡灰白色至灰白色，后期转变为灰褐色并产生褐色孢子层，在显微镜下可见分生孢子具有分隔，并且经过进一步分子鉴定确定为链格孢属真菌。培养5 d后，各烟区所采集的赤星病菌株的菌落直径（p=0.768 7）、产孢量（p=0.709 7）和萌发率（p=0.851 0）差异均不显著。

2.2  赤星病在四川省5个烟区的发生程度

图1显示，2017年至2019年6月底至9月初，烟草赤星病在宜宾、攀枝花、凉山、泸州、广元5个烟叶产区均有发生，整体发病规律为：烟草赤星病病情指数随着时间的推移逐渐升高，每年8月，各烟区赤星病病情指数均显著高于7月并趋于峰值。相同时间，各烟区赤星病病情指数存在差异。由此可以推测赤星病主要为害期为烟草成熟期及成熟后期。5个植烟区2019年烟草赤星病病情指数相对于2017年有所下降，但差异不显著。2017年至2019年5个植烟区烟草赤星病病情指数分别为：宜宾11.59～10.15，攀枝花12.67～10.59，凉山11.74～8.89，泸州11.89～9.41，广元10.04～9.26。

2.3  赤星病高效防治药剂筛选

田间试验结果表明（表3），第1次施药后7 d，各烟区药剂处理组的病情指数与对照组相比均有所下降，说明各药剂对赤星病的发生起到了一定的控制作用，但不同药剂在不同地区间控制效果不一致。在宜宾和广元，多数药剂控制效果显著，病情指数均与对照达到了显著差异，而在泸州、攀枝花和凉山只有1～2种药剂控制效果明显。除宜宾的T2和凉山的T3处理外，同一地区不同药剂之间的防治效果没有显著差异。第3次施药后7 d，随着赤星病的发展，处理组的防治效果逐渐显现，各地区5种药剂处理的病情指数均显著低于对照，防治效果均高于第1次施药后。从同一地区不同药剂的防治效果来看，各地区10%苯醚甲环唑水分散粒剂和40%菌核净可湿性粉剂对赤星病的防治效果均优于其他3种药剂，表现出较为一致的规律。

3  讨  论

链格孢菌具有生长周期短、产孢量大等特点，在田间易引发爆发性流行[5]。在前人研究中，我国部分地区烟草赤星病的病原菌均以链格孢属真菌为主，如唐明等[6]在不同植烟区采集烟草赤星病21个样品，鉴定结果表明所采集的赤星病病原均为链格孢菌;牛俊轲等[7]在黑龙江省和吉林省烟田采集了320个烟草赤星病典型病样，通过形态学和分子生物学方法确定2个省的烟草赤星病均为链格孢菌。本研究从四川5个烟区分离了烟草赤星病病原菌，形态学表现出链格孢属的典型特征，并且經过进一步分子鉴定确定为链格孢属。这与前人研究结果一致。此外，本研究还发现四川5个烟区的赤星病孢子在SDAY培养基上的生长速率、产孢量及萌发率无显著差异，且都表现出生长速率快和产孢量大等特点，具有在四川各市州引发流行的可能。

赤星病的发生与温度、湿度等环境因素密切相关。刘学敏等[5]发现越冬赤星病孢子或菌丝在适宜的温度和高湿环境下可以迅速生长并引发流行病。近年来，有学者研究了赤星病最适生长发育温度，发现环境温度在25～31 ℃时易引发赤星病流行[8-9]。本研究在四川5个烟区通过连续3年的调查，发现每年在7月底至8月，当连续阴雨或雨后晴天极易引发田间赤星病爆发，与上述相关研究结果一致。

赤星病主要侵染成熟期烟叶，此时烟叶细胞通透性增加，细胞壁被分解致使抗性减弱[10]，赤星病病原易于侵入;同时，烟叶细胞内可溶性糖含量增多，赤星病病原易于利用营养快速侵染[5]。贺刚等[11]研究了不同烟草品种对赤星病的抗性，发现云烟97表现出抗性，云烟87相对易感，因此种植抗病品种或利用免疫诱抗剂提高烟株自身抗病性是防治赤星病的有效手段。本研究在调查中还发现，烟田赤星病呈逐年下降趋势，主要原因是随着烟草病虫害绿色防控技术的推广，烟农逐渐接受绿色防控技术理念和产品，在烟叶生产过程中采用壮苗移栽和在苗期使用烟草免疫诱抗剂，提高了烟株自身的抗性。

本研究中，5种供试药剂在四川不同烟区对烟草赤星病的防治效果不同。总体上看，10%苯醚甲环唑水分散粒剂和40%菌核净可湿性粉剂对赤星病有较好的防治效果，且防效稳定。与陈杰等[12]、张彬彬等[13]范敬修等[14]研究结果一致。苯醚甲环唑为三唑类杀菌剂，能够高效防治多种真菌性病害，同时该药剂安全、低毒，不污染环境和农副产品[15-16]。但是，也有学者报道苯醚甲环唑和菌核净在云南、贵州、吉林、黑龙江等地对烟草赤星病菌的防效效果降低[17-20]。为了降低病原抗药性，提高防治烟草赤星病效果，建议交替使用10%苯醚甲环唑水分散粒剂和40%菌核净可湿性粉剂进行防治。

4  结  论

四川攀枝花、凉山、泸州、宜宾、广元5个烟区的赤星病病原菌均属于链格孢属菌（Alternaria spp.），各烟区赤星病病原菌生物学特性差异均不显著;5个烟区均发生烟草赤星病，整体发病规律为：每年6月底至8月，赤星病病情指数随着时间的推移逐渐增加;10%苯醚甲环唑水分散粒剂和40%菌核净可湿性粉剂对烟草赤星病防治效果最好，且防治效果稳定，可以作为应急药剂防治烟草赤星病。

参考文献

[1]JING C L， ZHAO J， HAN X B， et al. Essential oil of Syringa oblata Lindl. as a potential biocontrol agent against tobacco brown spot caused by Alternaria alternata [J]. Crop Protection， 2018， 104： 41-46.

[2]WANG H C， ZHANG C Q. Multi-resistance to thiophanate-methyl， diethofencarb， and procymidone among Alternaria alternata populations from tobacco plants， and the management of tobacco brown spot with azoxystrobin[J]. Phytoparasitica， 2018， 46： 677-687.

[3]李六英，窦彦霞，马冠华，等. 我国烟草赤星病菌遗传多样性的ISSR分析[J]. 植物保护学报，2018，45（4）：846-855.

LI L Y， DOU Y X， MA G H， et al. Genetic diversity analysis of tobacco brown spot pathogens in China by ISSR[J]. Journal of Plant Protection， 2018， 45（4）： 846-855.

[4]CHENG D D， JIA Y J， GAO H Y， et al. Characterization of the programmed cell death induced by metabolic products of Alternaria alternata in tobacco BY-2 cells[J]. Physiologia Plantarum， 2011， 141： 117-129.

[5]刘学敏，常稳，李大壮. 烟草赤星病研究现状及存在问题[J]. 东北农业大学学报，2000，31（1）：80-85.

LIU X M， CHANG W， LI D Z. Researching advance of tobacco brown spot caused by Alternaria alternata[J]. Journal of Northeast

Agricultural University， 2000， 31（1）： 80-85.

[6]唐明，向金友，謝冰，等. 宜宾烤烟赤星病致病力分化、生物学特性及抑菌药剂筛选研究[J]. 天津农业科学，2016，22（10）：96-101.

TANG M， XIANG J Y， XIE B， et al. Study on pathogenicity differentiation， biological characteristics of Alternaria alternata and screening of the effective fungicides in Yibin[J]. Tianjin Agricultural Sciences， 2016， 22（10）： 96-101.

[7]牛俊轲，卢宝慧，刘丽萍，等. 吉林省和黑龙江省烟草赤星病病原鉴定[J]. 中国烟草科学，2019，40（5）：52-59.

NIU J K， LU B H， LIU L P， et al. Identification of the pathogens causing tobacco brown spot disease in Jilin and Heilongjiang Provinces[J]. Chinese Tobacco Science， 2019， 40（5）： 52-59.

[8]STAVELY J R， MAIN C E. Influence of temperature and other factors on initiation of tobacco brown sopt[J]. Phytopathology， 1970（60）： 1591-1596.

[9]郭永峰. 赤星病抗源的抗性比较[J]. 中国烟草科学，1997（1）：1-6.

GUO Y F， ZHU X C， KONG F Y， et al. Comparison of resistance in various brown spot resistant varieties[J]. Chinese Tobacco Science， 1997（1）： 1-6.

[10]康子腾，蒋黎明，罗义勇，等. 植物病原链格孢属真菌的致病机制研究进展[J]. 生命科学，2013，25（9）：908-914.

KANG Z T， JIANG L M， LUO Y Y， et al. The research advances of mechanism of pathogenicity of Alternaria phytopathogenic fungi[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences， 2013， 25（9）： 908-914.

[11]贺刚，廖衡斌，李文宇，等. 烟草品种和打顶时期对烟草赤星病发病情况的影响[J]. 农学学报，2017（12）：65-69.