干露胁迫对脊尾白虾存活率及氧化应激反应的影响

邓高威，段健诚，王 玉，王林华，欧阳乐飞，高 焕,2,3，赖晓芳,2,3，张庆起，阎斌伦,2,3

(1.江苏海洋大学 海洋科学与水产学院，江苏省海洋生物技术重点实验室，江苏 连云港 222005；2.江苏省海洋资源开发研究院，江苏 连云港 222005；3.江苏省农业种质资源保护与利用平台，江苏 南京 210014；4.连云港赣榆佳信水产开发有限公司，江苏 连云港 222100)

脊尾白虾(Exopalaemoncarinicauda)分布于印度—西太平洋区、韩国和我国近海，是我国特有的广盐性经济虾类，其产量在我国东部沿海地区的混合养殖模式中占1/3。脊尾白虾繁殖能力强、生长速度快、环境适应性广[1]，养殖规模逐年增加[2]。

干露是指水生动物短时间或长时间离开水体的一种状态，是自然环境、养殖或运输等过程中常见的一种现象[3]。干露状态的甲壳动物主要遭受失水和低氧胁迫，产生过量活性氧、乳酸及有毒脂质过氧化物等，影响正常生理代谢，导致机体损伤或死亡。在机体受到干露胁迫时，抗氧化酶发挥重要作用。干露胁迫对贝类的影响已有大量研究，但对甲壳类动物的影响研究仅有少量报道。段亚飞等[4]研究表明，干露胁迫可显著影响日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)抗氧化酶活性。姜娜等[5]研究发现，随着干露时间的增加，三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)肝胰腺总抗氧化能力显著降低。然而，目前关于干露胁迫对脊尾白虾存活率和抗氧化系统的影响尚未见报道。笔者通过测定不同干露条件对脊尾白虾存活率和抗氧化酶活性的影响，旨在探讨不同干露条件下其耐干露能力和机制，为生产实践提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验用虾

脊尾白虾为本试验室自繁自育，选择健康活力强的个体用于试验，体长(4.1±0.1) cm，体质量(1.92±0.12) g，在1000 L的聚氯乙烯桶中暂养，90尾/桶。暂养海水盐度22，pH 8.0，温度25 ℃，持续充氧，每日早晚各投喂1次，每2 d换水1/3，暂养7 d。

1.2 干露胁迫试验

试验设置5组：1个对照组(继续暂养)和4个试验组(常温干燥组、常温湿润组、低温干燥组和低温湿润组)。每组30尾，3个平行。常温干燥组和常温湿润组：在封闭无风的室内进行，空调调制室温25 ℃，湿度62%～65%，脊尾白虾放于干净泡沫板上进行干露，常温湿润组每0.5 h喷洒一次海水，使其周围湿度为70%～75%。低温干燥组和低温湿润组：在冰箱保鲜层进行，设置温度6 ℃，低温湿润组每0.5 h喷洒一次海水，使其冰箱保鲜层湿度为70%～75%。

记录每组脊尾白虾各时间点的存活情况，并计算累计存活率。每组在试验开始的0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h各随机挑选3尾脊尾白虾，取肌肉组织冻存于-20 ℃冰箱，用于测定抗氧化酶活性。

1.3 样品制备

取0.2 g肌肉组织，放入4 mL离心管，加入1.8 mL预冷的0.86%生理盐水，制成10%组织匀浆。匀浆于低温离心机4 ℃、2000 r/min离心10 min，取上清液测定组织抗氧化酶活性。

1.4 酶活性的测定

组织蛋白和丙二醛含量及过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定。组织蛋白质量浓度采用考马斯亮蓝法。过氧化氢酶活性采用可见光法，其单位定义：每毫克组织蛋白每秒钟分解1 μmol的H2O2的量为1个酶活性单位(U)。谷胱甘肽过氧化物酶活性单位定义：每毫克蛋白质，每分钟扣除非酶反应的作用，使反应体系中谷胱甘肽过氧化物酶浓度降低1 μmol/L为1个酶活性单位(U)。超氧化物歧化酶活性采用羟胺法，其活性单位定义：每毫克组织蛋白在1 mL反应液中超氧化物歧化酶抑制率达50%时所对应的超氧化物歧化酶量为1个超氧化物歧化酶活性单位(U)。丙二醛质量摩尔浓度采用硫代巴比妥酸法，其单位定义是每毫克组织蛋白中丙二醛物质的量(nmol/mg)。

1.5 数据分析

试验数据以平均值±标准差表示，用统计分析软件SPSS 25.0 进行单因素方差分析和LSD多重比较，差异显著水平设为0.05。用Origin 2018绘制柱状图并标注差异显著标志。

2 结 果

2.1 干露胁迫对脊尾白虾存活率的影响

脊尾白虾累计存活率见表1。干露开始后脊尾白虾剧烈跳动，随着时间推移，可见其鳃丝伴随着头胸甲内的残余水分进行摆动，脊尾白虾触须和腿变绿，开始死亡。4个试验组脊尾白虾死亡速率由慢到快为：低温湿润组<低温干燥组<常温湿润组<常温干燥组。常温干燥组的脊尾白虾死亡速率最快，在3.0 h全部死亡，此时低温湿润组仍有40%个体存活；常温湿润组在试验开始后5.0 h全部死亡；低温湿润组存活时间最长，在12.0 h时仍有4.4%的个体存活；对照组脊尾白虾活力正常，未出现死亡。

表1 干露胁迫下脊尾白虾的累积存活率 %Tab.1 Cumulative survival rate of ridgetail white prawn E.carinicauda exposed to air exposure

2.2 干露胁迫对过氧化氢酶活性的影响

干露胁迫对脊尾白虾肌肉组织过氧化氢酶活性的影响见图1。与对照组相比，干露胁迫后，试验组脊尾白虾肌肉中过氧化氢酶活性显著上升(P<0.05)，常温干燥组在1.0 h达到最大值(8.63 U/mg)，是对照组的4.9倍(P<0.05)。常温湿润组在1.5 h达到最大值(8.26 U/mg)，是对照组的4.77倍(P<0.05)。低温干燥组于2.0 h达到最大值(6.70 U/mg)，是对照组的3.87倍(P<0.05)。低温湿润组于2.5 h达到最大值(10.27 U/mg)，是对照组的5.94倍(P<0.05)。单因素方差分析表明，试验组与对照组以及各试验组间过氧化氢酶活性差异显著(P<0.05)。单因素方差分析表明，试验组与对照组以及各试验组间过氧化氢酶活性差异显著(P<0.05)。

图1 干露胁迫对脊尾白虾肌肉组织过氧化氢酶活性的影响Fig.1 Catalase activities in muscular tissue of ridgetail white prawn E.carinicauda exposed to air exposure stress

2.3 干露胁迫对谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响

干露胁迫对脊尾白虾肌肉组织中谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响见图2。与对照组相比，在干露胁迫条件下，常温干燥组酶活性在2.5 h达到最大值(25.52 U/mg)，为对照组的1.35倍(P<0.05)。常温湿润组酶活性在0.5 h达到最大值(26.81 U/mg)，为对照组1.41倍(P<0.05)。低温干燥组酶活性在1.0 h达到最大值(21.77 U/mg)，为对照组1.49倍(P<0.05)。低温湿润组酶活性在2.5 h达到最大值(32.44 U/mg)，为对照组的1.71倍(P<0.05)。单因素方差分析结果表明，试验组与对照组以及各试验组间谷胱甘肽过氧化物酶活性差异显著(P<0.05)。

图2 干露胁迫对脊尾白虾肌肉组织谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响Fig.2 Glutathione peroxidase (GPx) activity in muscular tissue of ridgetail white prawn E.carinicauda exposed to air exposure stress

2.4 干露胁迫对超氧化物歧化酶活性的影响

干露胁迫对脊尾白虾肌肉中超氧化物歧化酶活性的影响见图3。与对照组相比，常温干燥组酶活性在2.5 h达到最大值(14.72 U/mg)，为对照组的1.59倍(P<0.05)。常温湿润组和低温湿润组酶活性均在2.0 h达到最大值(14.46 U/mg和12.72 U/mg)，分别为对照组的1.56倍和1.37倍(P<0.05)。低温干燥组酶活性在1.0 h达到最大值(10.11 U/mg)，为对照组的1.09倍(P<0.05)。单因素方差分析结果表明，试验组与对照组以及各试验组间超氧化物歧化酶活性差异显著(P<0.05)。

图3 干露胁迫对脊尾白虾肌肉组织超氧化物歧化酶活性的影响Fig.3 Superoxide dismutase activity in muscular tissue of ridgetail white prawn E.carinicauda exposed to air exposure stress

2.5 干露胁迫对丙二醛含量的影响

干露胁迫对脊尾白虾肌肉组织中丙二醛含量的影响见图4。与对照组相比，常温干燥组在1.5 h达到最大值(2.26 nmol/mg)，为对照组1.75倍(P<0.05)。常温湿润组和低温湿润组均在2.0 h 达到最大值(3.27 nmol/mg和2.92 nmol/mg)，为对照组2.53倍和2.26倍(P<0.05)。低温干燥组在1.0 h达到最大值(2.03 nmol/mg)，为对照组的1.57倍(P<0.05)。单因素方差分析结果表明，试验组与对照组以及各试验组间丙二醛含量差异显著(P<0.05)。

图4 干露胁迫对脊尾白虾肌肉组织丙二醛含量的影响Fig.4 Malonaldehyde content content in muscular tissue of ridgetail white prawn E.carinicauda exposed to air exposure stress

3 讨 论

3.1 干露胁迫对脊尾白虾存活率的影响

干露条件下水生动物的成活率受多种因素的影响，如温度、湿度、发育阶段[6-7]、形态差异[3]、物种[8]和干露时间等。研究发现，毛蚶(Scapharcasubcrenata)[9]耐干露能力受温度影响较明显，虾夷扇贝 (Patinopectenyessoensis)[6]和单环刺螠(Urechisunicinctus)[10]的耐干露能力随温度升高而降低；施氏獭蛤稚贝(Lutrariasieboldii)[11]和三疣梭子蟹幼体[12]在20 ℃耐干露能力较强；低温下厚壳贻贝(Mytiluscoruscus)的耐干露能力是高温时的3倍[13]。本试验中，低温干露组脊尾白虾的存活率高于常温干露组。可能是由于常温环境脊尾白虾鳃丝表面的水分蒸发快，鳃丝间水分会以更快的速度被蒸发，导致脊尾白虾因不能正常摄取氧气而加速死亡[14]。适当的降温能降低水生动物新陈代谢、耗氧率和体力消耗，对氧气、饵料和水分的需求减少，因此提高了耐干露能力[15]。

湿度也是影响干露存活率的另一个重要因素。处于干露状态下的口虾蛄(Oratosquillaoratoria)[16]、天津厚蟹(Helicetientsinesis)[17]、厚壳贻贝[13]和日本囊对虾[14]存活率与环境相对湿度呈正相关。本试验的结果类似，常温湿润组脊尾白虾存活时间高于常温干燥组，低温湿润组脊尾白虾存活时间高于低温干燥组。可能是因为甲壳动物主要通过鳃丝表面的水分来进行呼吸，空气中的氧气进入鳃丝表面的水分里，再以溶解氧的形式被利用，湿润环境增加鳃丝间的水分，提高鳃丝对空气中氧气的摄取能力，从而有效降低组织损伤，提高抗氧化能力。因此增加湿度可以减缓缺氧情况，提高耐干露能力和成活率[16]。

3.2 干露胁迫对脊尾白虾抗氧化系统的影响

在应激胁迫环境中，动物机体因代谢异常产生过量的活性氧自由基，主要包括超氧阴离子自由基、羟自由基和过氧化氢等，过量的活性氧可导致机体氧化损伤[18]。虾类在长期的进化过程中形成一套抗氧化酶系统，主要有过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶等，用来清除多余的活性氧，减少和避免氧化损伤对机体造成的损害[5]。因此，笔者选择了过氧化氢酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性、超氧化物歧化酶活性和丙二醛的含量与抗氧化系统相关的指标，来反映脊尾白虾在干露胁迫下机体生理生化变化情况。

过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶之间具有协同作用。生理条件下组织中存在一定活性氧自由基，超氧化物歧化酶中的Cu2+可被过氧化氢还原从而失去活性，过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶可清除过氧化氢，一定程度上保护了超氧化物歧化酶。超氧阴离子自由基又能使过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶失活，而超氧化物歧化酶可将生物体内的超氧阴离子自由基歧化为过氧化氢和氧气，保护这2种酶，3种酶形成互相保护的防御系统[19-20]。丙二醛既是机体内脂质过氧化反应的重要产物[21]，同时又可与蛋白质的游离氨基相互作用，引起蛋白质分子内与分子间交联，导致细胞损伤[22-23]。超氧化物歧化酶可缓解与调节细胞氧化应激，清除自由基，促使机体恢复。

本试验结果显示，干露胁迫条件下，过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性显著上升(图1)，超氧化物歧化酶活性则呈先降后升趋势(图3)，而丙二醛含量总体呈先升后降的趋势(图4)。分析可能是胁迫时产生的大量超氧阴离子自由基被超氧化物歧化酶还原成过氧化氢，超氧阴离子自由基的减少以及过氧化氢的大量产生，导致超氧化物歧化酶活性的下降[24]。超氧化物歧化酶活性随着时间的推移呈上升趋势，可能是在过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶作用下，过氧化氢被分解成水和氧气，抑制解除。过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性显著升高，说明干露胁迫导致脊尾白虾缺氧，使体内活性氧自由基显著增加，进而导致酶活性的升高[4]，机体需要提高抗氧化酶活性来适应这种胁迫环境[25]。de Almeida等[26]研究发现，干露胁迫后棕色贻贝(Pernaperna)肝胰腺中脂质过氧化物含量显著增加。本试验中，丙二醛含量呈先升后降的趋势，表明干露初期过量活性氧超出脊尾白虾抗氧化防御能力，对机体造成氧化损伤甚至致其死亡[27]；随着活性氧积累，激化了抗氧化系统，增强了清除自由基的能力，使丙二醛含量下降。超氧化物歧化酶活性间接反映了机体清除氧自由基的能力，而丙二醛的含量间接反映了机体受自由基攻击的严重程度，两者相互配合使用，有利于更好地了解脊尾白虾的健康状况[28]。

4 结 论

综上所述，干露胁迫可诱导脊尾白虾产生氧化应激反应，使过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性发生显著变化，以消除丙二醛等有害物质。适量的降低温度、提高湿度可降低干露胁迫所带来的机体损伤，显著提高脊尾白虾干露胁迫下的存活率。