哮喘患儿外周血单个核细胞瘦素与RORγt和Foxp3表达的关系

柳菊芬 沃小敏 潘阳 李明安

【摘要】 目的：探討哮喘患儿外周血单个核细胞（PBMC）分泌的瘦素水平变化及其与Th17特异性转录因子维甲酸相关孤儿核受体γt （RORγt）和Foxp3+调节性T细胞（Treg）特异性转录因子叉头状转录因子p3（Foxp3）表达的关系。方法：选取2018年6月-2020年6月本院收治的25例哮喘患儿设为哮喘组。根据哮喘组患儿疾病所处的时期不同，分为发作期和缓解期。对哮喘发作期儿童经规则联合吸入糖皮质激素/长效β2受体激动剂（ICS/LABA）治疗后定期随访，无症状和体征超过3个月以上作为缓解期。选取同期在本院体检25例的健康儿童为对照组。比较哮喘组发作期和缓解期及对照组的瘦素、FEV1%、RORγt mRNA及Foxp3 mRNA表达水平，并分析哮喘组发作期患儿瘦素与PBMC的FEV1%、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA及RORγt mRNA与Foxp3 mRNA的相关性。结果：对照组、哮喘组发作期和缓解期的瘦素、FEV1%、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA比较，差异均有统计学意义（P<0.01）。哮喘组发作期的瘦素、RORγt mRNA相对表达量均高于对照组和哮喘组缓解期，FEV1%、Foxp3 mRNA均低于对照组和哮喘组缓解期，差异均有统计学意义（P<0.01）。对照组和哮喘组发作期的瘦素、FEV1%、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA比较，差异均无统计学意义（P>0.01）。哮喘组患儿发作期PBMC培养上清液瘦素浓度与PBMC的RORγt mRNA呈正相关（r=0.884，P<0.01）;与PBMC的Foxp3 mRNA呈负相关（r=-0.926，P<0.01）;与FEV1%呈负相关（r=-0.936，P<0.01）;Foxp3 mRNA与RORγt mRNA呈负相关（r=-0.854，P<0.01）。结论：哮喘患儿PBMC分泌的瘦素与RORγt mRNA呈正相关，与Foxp3 mRNA呈负相关。

【关键词】 瘦素 哮喘 外周血单个核细胞 维甲酸相关孤儿核受体γt 叉头状转录因子p3

[Abstract] Objective： To investigate the levels of leptin derived by the peripheral blood mononuclear cells （PBMC） and the effect on RORγt （the transcription factor of Thl7 cells） and Foxp3 （the transcription factor of Foxp3+Treg cells） in children with asthma. Method： A total of 25 children with asthma admitted to our hospital from June 2018 to June 2020 were selected as the asthma group. According to the different period of the asthma group， the children were divided into attack stage and remission stage. Children in attack stage of asthma would be followed up regularly after regular treatment with inhalationcorticosteroid/long-acting β2 receptor agonists （ICS/LABA）， with no symptoms or signs for more than 3 months as the remission period. A total of 25 healthy children who underwent physical examination in the same period were selected as the control group. The levels of leptin， FEV1， RORγt mRNA and Foxp3 mRNA in the attack and remission stages of the asthma group and the control group were compared during attack and remission period. The correlation between leptin and FEV1， RORγt mRNA and Foxp3 mRNA in PBMC and between RORγt mRNA and Foxp3 mRNA of asthmatic group were analyzed. Result： There were no significant differences in the levels of leptin， FEV1%， RORγt mRNA and Foxp3 mRNA in the attack and remission stages of the asthma group and the control group （P<0.01）. The levels of leptin and RORγt mRNA in the attack stage of asthma group were higher than those of control group and asthma group at remission stage， and the levels of FEV1% and Foxp3 mRNA were lower than those of control group and asthma group at remission stage， the differences were statistically significant （P<0.01）. There were no significant differences in the levels of leptin， FEV1%， RORγt mRNA and Foxp3 mRNA between control group and the asthma group at remission stage （P>0.01）. There was positive correlation in the attack stages of the asthma group between the concentration of leptin in the supernatant of PBMC culture and the RORγt mRNA in PBMC （r=0.884， P<0.01）; and PBMC Foxp3 mRNA was negatively correlated （r=-0.926， P<0.01）; FEV1% was negatively correlated （r=-0.936， P<0.01）; Foxp3 mRNA was negatively correlated with RORγt mRNA （r=-0.854， P<0.01）. Conclusion： The leptin secreted by PBMC in asthmatic children was positively correlated with RORγt mRNA and negatively correlated with Foxp3 mRNA.

[Key words] Leptin Asthma Peripheral blood mononuclear cells RORγt Foxp3

First-author’s address： Shuyang People’s Hospital， Shuyang 223600， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.17.016

支气管哮喘是由多因素共同作用、多种细胞及其细胞因子共同参与的呼吸道慢性炎症性疾病。肥胖是支气管哮喘的危险因素之一，且呈剂量依赖性[1-4]。瘦素为脂肪组织分泌的一种激素，其结构与IL-6、IL-12、G-CSF等细胞因子相似，参与机体的免疫调节，尤其在机体能量调节中起着重要的作用，在哮喘发病过程中也起着重要作用[5]。Th17是胸腺來源的CD4+ T细胞，Th17细胞以分泌白介素17（IL-17）为特征，其上游调控基因为维甲酸相关孤儿核受体γt （RORγt），Treg具有免疫调节和维持机体免疫耐受的作用，目前认为其上游调控基因主要为叉状头转录因子p3（Foxp3）[6-7]。Th17和Treg在分化和功能上相互抑制，两者失衡与多种自身免疫性疾病有关，研究表明，哮喘的发病与Th1/Th2失衡有关[8-9]。但大量的研究表明哮喘的发病机制并不能简单地用Th1/Th2失衡机制来解释，在哮喘的发病过程中，Th17与Treg及其分泌的细胞因子也参与其中，因此Th17/Treg失衡也可能是哮喘发病机制之一，哮喘发病过程中不仅有Th1/Th2的失衡，也可能同时存Th17/Treg的失衡。

本研究分离哮喘患儿外周血单个核细胞并培养，检测其上清液瘦素的浓度值，采用PCR法分别检测Th17与Foxp3+ Treg上游特异性转录因子RORγt、Foxp3 mRNA相对表达量，并分析瘦素与RORγt、Foxp3 mRNA表达的相关性，以探讨瘦素在哮喘发病机制中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年6月-2020年6月本院收治的25例哮喘患儿设为哮喘组。纳入标准：（1）哮喘的诊断符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》（2008版）[10];（2）经治疗后缓解期随访数据完整。排除标准：（1）合并肺结核、支气管肺炎等呼吸道疾病;（2）合并肾小球肾炎、风湿性疾病等免疫性疾病;（3）合并恶性肿瘤;（4）就诊前1个月应用过免疫抑制剂。选取同期在本院体检的25例健康儿童为对照组，纳入标准：体检显示健康。排除标准：依从性差、不配合。根据哮喘组患儿疾病所处的时期不同，分为发作期和缓解期。对哮喘发作期儿童经规则联合吸入糖皮质激素/长效β2受体激动剂（ICS/LABA）治疗后定期随访，无症状和体征超过3个月以上作为缓解期。本研究经医院伦理委员会批准，所有入组儿童监护人均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 BMI的测定 测量所有入选儿童的身高和体重，并计算其体质指数（BMI），BMI=体重（kg）/身高2（m2）。

1.2.2 外周血的采集及单个核细胞的分离和培养 哮喘组患儿发作期于治疗前采集外周血，哮喘组缓解期于缓解期采集外周血，对照组于体检时采集外周血。均空腹采集静脉血5 mL，三组标本均用肝素钠抗凝，采用Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液分离得人外周血单个核细胞，同时分离血浆于（-80 ℃）保存待测。将分离的外周血单个核细胞用1640培养液（培养液内含有10%胎牛血清）重悬后接种于24孔板（每孔0.5 mL），终浓度为2×106/mL。加入anti-CD28（2 mg/L）、anti-CD3（10 mg/L）抗，链霉素（100 μg/mL）、青霉素（100 U/mL），放置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养72 h，收集培养上清液于（-80 ℃）保存待测，并收集细胞。

1.3 观察指标 比较哮喘组发作期和缓解期及对照组的瘦素、FEV1%、RORγt mRNA及Foxp3 mRNA表达水平，并分析哮喘组患儿发作期瘦素浓度与PBMC的FEV1%、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA及RORγt mRNA与Foxp3 mRNA的相关性。（1）PBMC中RORγt mRNA及Foxp3 mRNA的测定。采用Invitrogen公司的TRIzol Reagen试剂提取单个核细胞的总RNA，逆转录成cDNA（东洋纺试剂盒），合成的cDNA于（-80 ℃）中保存备用，以提取的cDNA为模板。用CFX 96荧光PCR仪，按照Bio-Rad Sybr Green Super Mix说明书要求，以GAPDH为内参测定RORγt及Foxp3的相对表达量，每个标本扩增三次，然后算其均值。扩增所用引物序列，RORγt上游引物为：5’-CCTGGGCTCCTCGCCTGACC-3’，下游引物为：5’-TCTCTCTGCCCTCAGCCTTGCC-3’;Foxp3上游引物为：5’-GAAGCAGCGGACACTCAATG-3’，下游引物为：5’-AGGTGGCAGGATGGTTTCTG-3’;GAPDH上游引物为：5’-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3’，下游引物为：5’-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3’。根据标准曲线计算RORγt、Foxp3及GAPDH的Ct值，以GAPDH为内参校准Foxp3的相对表示达量，结果分别用RORγt/GAPDH mRNA及Foxp3/GAPDH mRNA相对值来表示。（2）瘦素的检测。酶联免疫吸附测定法检测外周血单个核细胞培养上清液的瘦素浓度（试剂盒由R&D system公司提供），具体操作过程按试剂说明书的要求进行，用酶标仪（生产厂家：Bio-Tek Instruments，型号：uQuant）读取吸光度值，用试剂盒标准曲线来计算相应吸光值的瘦素浓度。（3）FEV1的检测。儿童FEV1与年龄相关，本研究采用（实际值/预计值）×100%（FEV1%）表示。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，三组数据比较用方差分析，两组数据比较采用t检验。以P<0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 哮喘组男14例，女11例，平均年龄（8.20±2.16）岁，平均BMI（17.11±3.52）kg/m2。对照组男14例，女11例;平均年龄（8.32±2.32）岁，平均BMI（17.21±3.45）kg/m2。两组一般资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

2.2 两组外周血单个核细胞培养上清液所测瘦素的浓度及外周血单个核细胞中RORγt mRNA、Foxp3 mRNA相对表达量的比较 对照组、哮喘组发作期和缓解期的瘦素、FEV1%、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA比较，差异均有统计学意义（P<0.01）。哮喘组发作期的瘦素、RORγt mRNA相对表达量均高于对照组和哮喘组缓解期，FEV1%、Foxp3 mRNA均低于对照组和哮喘组缓解期，差异均有统计学意义（P<0.01）。对照组和哮喘组发作期的瘦素、FEV1%、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA比较，差异均无统计学意义（P>0.01）。见表1。

2.3 哮喘组患儿发作期瘦素浓度与PBMC的RORγt mRNA、Foxp3 mRNA及FEV1%的相关性分析 采用直线回归相关性分析显示，哮喘组患儿发作期PBMC培养上清液瘦素浓度与PBMC的RORγt mRNA呈正相关（r=0.884，P<0.01）;与PBMC的Foxp3 mRNA呈负相关（r=-0.926，P<0.01）;与FEV1%呈负相关（r=-0.936，P<0.01）;Foxp3 mRNA与RORγt mRNA呈负相关（r=-0.854，P<0.01）。见图1～4。

3 讨论

哮喘是气道慢性炎症伴随高通反应的可逆性气道阻塞性疾病，通常认为Th1/Th2细胞失衡是其发病的主要机制。哮喘患者Th1型免疫反应减弱，Th2细胞免疫应答增强，Th2细胞分泌的IL-4、IL-5等细胞因子能增加IgE，并能促进嗜酸性粒细胞浸润，是哮喘气道炎症的主要因素[11]。有研究显示，并非所有哮喘都向Th2分化偏移，不能简单地用Th1/Th2失衡来解释哮喘的发病机制，Th1细胞增加反而可能加重哮喘症状[9]。胡斯明等[12]研究发现哮喘小鼠Treg/Th17显著低于对照组，且与细胞因子相关，提示了哮喘的发病机制也可能和Treg/Th17的失衡机制相关。施宇衡等[13]研究表明，具有特征性转录因子的Th17细胞及其细胞因子在哮喘发病中起重要作用，这些都证明了Treg、Th17参与了哮喘的发病机制。本研究结果显示，对照组、哮喘组发作期和缓解期的瘦素、FEV1%、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA比较，差异均有统计学意义（P<0.01）。哮喘组发作期的瘦素、RORγt mRNA相对表达量均高于对照组和哮喘组缓解期，FEV1%、Foxp3 mRNA均低于对照组和哮喘组缓解期，差异均有统计学意义（P<0.01）。对照组和哮喘组发作期的瘦素、FEV1%、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA比较，差异均无统计学意义（P>0.01）。而RORγt与Foxp3分别为Th17和Foxp3+ Treg的上游调控基因，因此RORγt mRNA和Foxp3 mRNA表达失衡可能是导致哮喘患儿Th17/Treg失衡的主要机制。

哮喘的发病机制比较复杂，瘦素通过何种途径参与其发病机制目前尚不清楚[14]。但有研究表明肥胖哮喘患者，症状较重且疗效差，血清高瘦素浓度可增加小儿哮喘的发病风险[15-16]。本研究显示，哮喘组患儿发作期PBMC培养上清液瘦素浓度与PBMC的RORγt mRNA呈正相关（r=0.884，P<0.01）;与PBMC的Foxp3 mRNA呈负相关（r=-0.926，P<0.01）;与FEV1%呈负相关（r=-0.936，P<0.01）;Foxp3 mRNA与RORγt mRNA呈负相关（r=-0.854，P<0.01）。表明哮喘患儿急性期外周血单个核细胞分泌的瘦素增加，且与肺功能损伤密切相关。可见PBMC分泌的瘦素在哮喘发病机制中起重要作用。瘦素可通过抑制Treg的功能而导致哮喘的发生[17]。有研究对有瘦素基因或瘦素受体基因缺陷的小鼠进行瘦素阻断，发现能够延缓小鼠自身免疫性脑脊髓的发展[18]。有研究表明，人外周血单个核细胞培养，瘦素能增加Th17的数量并呈剂量依赖性[19]。因此可以推测在哮喘发病机制中瘦素也能参与Th17/Treg平衡的调节。本研究结果显示，哮喘患儿急性期PBMC培养上清液中的瘦素浓度与PBMC的RORγt mRNA呈正相关与PBMC的Foxp3 mRNA呈负相关，瘦素的结构与白介素-6相似，白介素-6能调节Treg/Th17的平衡，因此哮喘患儿PBMC来源的瘦素也可能对Treg/Th17的平衡起重要的调节作用[20]。有研究在培养液加瘦素抗体，结果PBMC的Foxp3的表达量显著增高，表明瘦素可通过对RORγt与Foxp3表达的调节参与对Th17/Treg平衡的调节[21]。

Th17和Treg在分化和功能上相互抑制，其分化成熟主要受其上游转录因子RORγt和Foxp3的调控[6，22]。而本研究结果显示，PBMC分泌的瘦素参与了哮喘患儿RORγt mRNA和Foxp3 mRNA平衡的调节，提示其对Th17/Treg平衡也起重要调节作用，可能的机制是瘦素通过介导RORγt的表达从而增加Th17致病作用;通过抑制Foxp3的表达，进而抑制了Treg的免疫调节作用。

综上所述，哮喘患儿PBMC分泌的瘦素与RORγt mRNA呈正相關，与Foxp3 mRNA呈负相关。

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（收稿日期：2021-04-02） （本文編辑：张明澜）