消瘀泄浊饮介导PI3K/Akt/mTOR信号通路改善糖尿病肾病小鼠肾纤维化*

陈 峰 徐瑜琳 陈红波 项晓骏#

1 湖州南太湖医院 浙江 湖州 313008

2 浙江省中医院 浙江 杭州 310018

组织纤维化可通过PI3K/Akt/mTOR信号通路介导，且糖尿病肾病(DN)肾纤维化进展也与调控该信号通路相关。动物实验表明，对于肾损伤、肾纤维化大鼠，消瘀泄浊饮可通过抑制该信号通路发挥保护肾功能的作用[1-3]。基于此，本研究通过DN模型，分析消瘀泄浊饮对DN小鼠肾纤维化和肾损伤的保护作用，并探讨潜在机制，为临床治疗DN提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物：60只6周龄糖尿病模型（db/db）小鼠购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证号SCXK(沪)2017-0015；饲养于浙江中医药大学动物实验中心，饲养许可证号SYXK(浙)2018-0012。自由饮食饮水。

1.2 主要材料与仪器：消瘀泄浊饮颗粒剂（炙黄芪20g，车前草15g，制大黄、酒地龙、桃仁、川牛膝各10g，江苏天江药业有限公司），完全溶解于600ml灭菌水中煎煮1h，共煎2次，混合于旋转蒸发器浓缩，制备消瘀泄浊饮药液(0.96g/ml)，4℃冰箱中贮存。根据人的体重与剂量进行换算，配制高、中、低3个浓度的中药，分别为7.5、15、30g/（kg·d）(60kg成人的消瘀泄浊饮每日剂量为 96g)。Anti-beta Actin、Anti-pan-AKT、Anti-AKT、Anti-TGF beta 1抗体(批号：ab8226、ab8805、ab38449、ab92486)购于Abcam；mTOR、p-mTOR、p-PI3K、PI3K抗体(批号：AF6308、AF3308、AF3242、AF6242)购于Affinity。苏木素染液、DAB kit(批号：MD911467、MD912068)购于MDL。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒(批号：IC-SOD-Ra、IC-MDA-Ge)购于IC/IBL。ASP200S全自动脱水机、G1150 H加热石蜡包埋系统(Leica)。

1.3 制备DN肾纤维化模型与分组：适应性喂养1周后，尾静脉采集db/db小鼠血标本，对空腹血糖值进行测量，若出现＞11.1mmol/L，则视为造模成功。选取同周龄db/m小鼠12只，设为正常组。阳性对照组给予16mg/（kg·d）厄贝沙坦，消瘀泄浊饮低、中、高剂量组(XXD-L组、XXD-M组、XXD-H组)分别给予7.5、15、30g/（kg·d）消瘀泄浊饮；正常组、DN组利用等体积生理盐水灌胃，各组小鼠每日定时、持续8周灌胃，期间按小鼠体重变化程度调整剂量。

1.4 血糖监测：每周监测各组小鼠体重及血糖波动情况，取尾静脉血测量前，应对各组禁食8 h，血糖试纸测空腹血糖值。

1.5 常规指标检测：给药8周后，处死小鼠前1d将各组小鼠置于单独的代谢笼中以便采集小鼠24h尿液用以测量尿肌酐(Ucr)水平，同时行眼眶取血，收集、离心获取血清，以测定血清中尿素氮（BUN）含量。

1.6 肾脏指数：各组小鼠于给药8周结束后采用颈脱臼法处死，常规解剖摘取肾脏组织并标记，称重，计算肾脏指数(%)=肾脏质量/体重×100%。

1.7 氧化应激指标检测：参照相关试剂盒说明，按步骤检测并记录肾脏组织SOD、MDA水平。

1.8 HE、Masson染色：相应肾脏组织置于4%PFA中，脱水、包埋，切片机上切片，厚为4μm，展平于60℃烘箱内烘烤，二甲苯脱蜡，水化。HE、Masson染色按照试剂盒说明进行处理；常规脱水、透明、封片。显微镜拍照，进行图像采集，并分析肾脏组织病理改变和纤维化程度。

1.9 Western Blot检测：Western Blot检测各组小鼠肾组织转化生长因子 β1（TGF-β1）、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR表达水平。取肾组织样品，加1ml冷Lysis Buffer，碾碎组织，裂解，提取总蛋白。BCA法测定。SDS-PAGE电泳分离，转PVDF膜，封闭，TBST洗膜，加一抗(TGF-β1、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR)，4℃振荡过夜孵育，加相应二抗，室温孵育1～2h，洗膜。以β-actin为内参，化学发光处理，chemi capture软件拍摄处理图像。

1.10 统计学处理：应用SPSS 19.0统计软件，计量资料用均数±标准差(±s)表示，两组间用t检验比较，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 消瘀泄浊饮对小鼠空腹血糖的影响：与正常组比较，DN组空腹血糖显著升高(P＜0.01)。与DN组比较，各给药组可不同程度下降空腹血糖浓度，但XXD-L组变化无统计学意义(P＞0.05)，阳性对照组、XXD-M组、XXD-H组空腹血糖呈显著性降低(P＜0.05或P＜0.01)。见图1。

图1 消瘀泄浊饮对小鼠空腹血糖的影响

2.2 消瘀泄浊饮对小鼠Ucr、BUN水平的影响：DN组尿液中Ucr水平较正常组显著降低，而血清中BUN水平显著升高(P＜0.01)。各给药组均可在一定程度上改善Ucr、BUN水平，与DN组比较，仅阳性对照组和XXD-H组可显著升高Ucr水平(P＜0.01，P＜0.05)，降低BUN水平(P＜0.01，P＜0.05)，XXD-M组仅Ucr水平显著升高(P＜0.05)，BUN无显著变化(P＞0.05)，XXD-L组Ucr、BUN水平无显著变化(P＞0.05)。见表1。

表1 消瘀泄浊饮对小鼠Ucr、BUN水平的影响（±s)

表1 消瘀泄浊饮对小鼠Ucr、BUN水平的影响（±s)

注：与DN组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别正常组DN组阳性对照组XXD-L组XXD-M组XXD-H组BUN(mg/dL)5.59±0.56**7.60±0.78 6.42±0.53**7.45±0.79 7.42±0.83 6.85±0.56*例数12 12 12 12 12 12剂量— —16mg/（kg·d）7.5g/（kg·d）15g/（kg·d）30g/（kg·d）Ucr(µmol/L)1997.96±235.58**585.60±84.80 798.13±130.41**614.91±50.93 649.57±45.67*671.72±67.59*

2.3 消瘀泄浊饮对小鼠肾脏指数的影响：与正常组比较，DN组肾脏指数显著升高(P＜0.01)。给药处理后，可降低肾脏指数，与DN组比较，XXD-L组、XXD-M组无显著变化(P＞0.05)；而阳性对照组、XXD-H组肾脏指数显著降低(P＜0.01，P＜0.05)。见表2。

表2 消瘀泄浊饮对小鼠肾脏指数的影响（±s)

表2 消瘀泄浊饮对小鼠肾脏指数的影响（±s)

注：与DN组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别正常组DN组阳性对照组XXD-L组XXD-M组XXD-H组肾脏指数(%)0.58±0.112**0.76±0.080 0.66±0.095**0.71±0.113 0.69±0.096 0.67±0.097*例数12 12 12 12 12 12剂量——16mg/（kg·d）7.5g/（kg·d）15g/（kg·d）30g/（kg·d）体重(g)27.01±2.16**34.75±2.75 31.95±1.88**34.94±3.18 34.49±2.54 32.65±1.85*肾脏质量(g)0.15±0.019**0.26±0.018 0.21±0.026**0.25±0.031 0.24±0.026 0.22±0.028**

2.4 消瘀泄浊饮对小鼠肾脏组织SOD活性、MDA水平的影响：与正常组比较，DN组SOD活性显著降低(P＜0.01)，MDA含量显著升高(P＜0.01)。给药处理后，SOD活性、MDA水平均有所改善，与DN组比较，XXD-L组无显著变化(P＞0.05)，阳性对照组、XXD-M组、XXD-H组可显著升高SOD活性(P＜0.05)，显著降低MDA水平(P＜0.01)。见图2。

图2 消瘀泄浊饮对小鼠肾脏组织SOD活性、MDA水平的影响

2.5 消瘀泄浊饮对小鼠肾脏组织病理变化的影响：HE染色，正常组肾脏整体结构清晰，且较为完整，基底膜光滑，可见规则形态的肾小球，紧密整齐排列的肾小管，炎性细胞无浸润。DN组可见肾小球体积增大，紊乱结构的肾小管，基底膜增厚，炎性细胞浸润增多。给药处理后，除XXD-L组外均可不同程度恢复肾脏结构，肾小管排列趋于紧密，缩小肾小球体积，基底膜厚度降低，炎性细胞浸润少，其改善程度从高到低依次为阳性对照组、XXD-H组、XXD-M组。见图3。

图3 消瘀泄浊饮对小鼠肾脏组织病理变化的影响(HE染色，200、400倍)

2.6 消瘀泄浊饮对小鼠肾脏纤维化程度的影响：Masson染色。正常组小鼠肾间质及肾小球未见纤维组织增生，无异常改变；而DN组可见大量肾间质纤维化，给药处理后，除XXD-L组外，均可有效减轻纤维组织增生症状，减小肾小球体积，其改善程度从高到低依次为：阳性对照组、XXD-H组、XXD-M组。见图4。

图4 消瘀泄浊饮对小鼠肾脏纤维化程度的影响(Masson染色，400倍)

2.7 消瘀泄浊饮对小鼠肾组织中TGF-β1、p-PI3K、p-Akt和p-mTOR表达的影响：各组小鼠肾组织AKT、PI3K和mTOR蛋白表达无显著性差异(P＞0.05)，其余蛋白表达均呈上升趋势，DN组与正常组差异显著(P＜0.01)。与DN组比较，各给药组均可下调肾脏组织p-Akt/AKT、p-PI3K/PI3K蛋白表达(P＜0.05或P＜0.01)；仅阳性对照组和XXD-H组可显著下调p-mTOR/mTOR蛋白表达(P＜0.05，P＜0.01)；除XXD-L组外，阳性对照组、XXD-M组、XXD-H组均显著下调TGF-β1蛋白表达(P＜0.05或P＜0.01)。见图5。

图5 消瘀泄浊饮对小鼠肾组织中TGF-β1、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR和mTOR表达的影响

3 讨论

DN在中医学属“尿浊”“消渴”“水肿”等范畴，病机复杂，糖尿病是其发病之本，久病伤正，气阴耗伐，加重五脏虚衰，致阴损及阳，阴阳两虚；燥热、瘀血、痰浊等交杂，是以本虚标实、虚实交杂为DN主要病机。脾肾亏虚，肾主藏精，脾主运化，脾虚则不能固摄，湿浊内停，泛溢肌肤，则为水肿；肾气亏虚则精气下泄，致蛋白尿。脾肾亏虚，血运不畅，则经脉瘀阻，致湿、毒、瘀、热产生。DN病程冗长，病情复杂多变，宜以补益脾肾、消瘀泄浊为治疗之根本。

消瘀泄浊饮临床上广泛应用于肾功能不全的治疗，针对气虚夹瘀浊证为主，方中黄芪壮脾胃，益正气，补肾脏之虚，为君药；制大黄逐瘀通经，亦可凉血解毒、荡涤肠胃，引出浊毒之邪，为臣药；川牛膝祛风利湿、通经活血，桃仁活血祛瘀，二者协同可活血化瘀、导浊毒之邪外出，加之地龙搜风剔络、善入经脉，三者相配可加大活血、化瘀通络之效，推陈出新，为佐药；车前草为使，清热利尿、凉血解毒。全方诸药，共奏水行浊泄、气足血行瘀祛之效，切合DN病机。