凡纳滨对虾养殖期间水体及肠道菌群变化研究

吕孙建 袁雪梅 张海琪 刘莉 于喆 杭小英 施伟达

摘要：近年，由于凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）养殖业疾病频发，且病原种类复杂多样，对对虾养殖业造成巨大的影响，其中又以细菌病最为普遍及严重。以浙江某养殖场的6口养殖塘作为试验塘，在养殖至20 d后开始分别采用水质监测试剂盒及高通量测序等方法连续监测水质指标、水体及对虾肠道微生物群变化情况，从而了解在对虾疾病高发期水体和虾体中微生物群的动态规律。研究发现随着养殖时间延长，水体中的氨氮、硫化氢、钙离子、总氮和总磷等指标会出现显著上升。另外，养殖塘中的主要微生物群为蓝藻细菌纲和变形菌纲类细菌，且蓝藻细菌纲和γ-变形菌纲-弧菌微生物群到养殖后期数量显著上升;对虾肠道中的主要微生物群为γ-变形菌纲-弧菌，在养殖中期有明显上升。本研究首次研究了在对虾疾病高发期水体和虾体中的主要微生物群种类，为后续病害防控技术研发提供一定的理论依据。

关键词：凡纳滨对虾;微生物群;γ-变形菌纲;蓝藻细菌纲

中图分类号： S945.1+2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2021）02-0125-06

收稿日期：2020-06-03

基金资助：浙江省科研院所扶持专项（编号：2020YSZX002、2020YSZX010）。

作者简介：吕孙建（1988—），男，浙江温州人，博士，助理研究员，主要从事水产动物病害防治。E-mail：lvsunjian@163.com。

通信作者：张海琪，硕士，正高级工程师，主要从事水产育种和病害防治。E-mail：zmk407@126.com。

凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei），属于节肢动物门、甲壳纲、十足目、旅游亚目、对虾科、对虾属，是广温广盐性热带虾类。该虾具有个体大、生长快、营养需求低、抗病力强、产量高等优点，是集约化高产养殖的优良品种，也是目前世界上养殖产量最高的三大虾类之一[1-2]。近年来，由于高密度养殖盛行、药物滥用、养殖水体恶化和种质退化等原因，凡纳滨对虾养殖业疾病频发，且病原种类复杂多样，包括病毒类、细菌类、寄生虫类、真菌类和原生动物类等，其中又以细菌病最为严重，如副溶血弧菌、霍乱弧菌、河流弧菌和其他细菌等条件致病性细菌均能导致对虾大量死亡[3-5]。

自然条件下，对虾养殖水体中的微生物群存在一定的动态平衡，病毒、细菌、寄生虫、真菌和原生动物相互制约并保持水体的稳定，但由于外来物质，如过量饲料投喂、抗生素和化学药物的滥用[6-7]：一方面扰乱对虾的免疫系统，极大降低对虾本身的免疫力;另一方面又导致水体营养成分失衡，水体和对虾肠道内的微生物群动态平衡紊乱，病原微生物大量增殖，有益微生物大量减少。因此，研究现有养殖环境下，水体和对虾肠道中微生物菌群的变化，对了解目前对虾细菌性疾病暴发的原因和后续防控技术的研发具有深远的意义。据已有的文献报道，目前关于凡纳滨对虾水体及肠道微生物群动态变化的研究较少，只有少量文章涉及这方面的研究。孙振丽对凡纳滨对虾肠道和水体中的微生物群进行检测，发现水和虾肠道中检测到的共有细菌属为119株，证明水体和肠道中细菌存在密切的相互作用[8]。宛立等通过分离纯化培养法，从健康凡纳滨对虾肠道中检测到111株细菌，但一些难以培养的优势菌种或低丰度菌种则检测不出，因此研究结果不能全面地反映凡纳滨对虾肠道微生物的种群数量及多样性[9]。李可和刘淮德分别用16S rDNA 克隆文库法和变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技术对凡纳滨对虾肠道菌群进行检测，均发现了12种细菌，其中李可发现厚壁细菌和变形细菌为对虾肠道的优势菌，各占75.4%和246%[10-11]。

本研究拟用高通量测序技术对浙江某凡纳滨对虾养殖场进行连续监测，通过在凡纳滨对虾疾病高发期（养殖从20 d到50 d左右）连续监测水体和对虾肠道中的微生物菌群，了解养殖期间微生物的动态变化，包括主要微生物种类的变化、各类微生物数量的波动情况，为后续细菌性疾病研究和相应防控产品研发提供一定的理论依据。

1材料与方法

1.1地点

本次研究以浙江某养殖场的6口凡纳滨对虾养殖塘为监测点，从养殖20 d（7月11日）开始采集样品并检测，每周采集1次样品，连续监测5周，至养殖 48 d结束（8月8日）。

1.2方法

1.2.1样品采集监测塘口采集水样和对虾样品：采集每口养殖塘中心处底层水样500 mL并4 ℃保存，用于水质检测和水体微生物菌群检测;随机采集每口养殖塘对虾20 尾，-80 ℃保存，用于对虾菌群多样性检测。

1.2.2水质检测水质检测指标包括水温、溶解氧、pH值、氨氮（NH+4-N）、亚硝酸盐（NO-2-N）、硫化氢（H2S）、总氮（TN）、总磷（TP）和钙离子（Ca2+），其中，水温、溶解氧和pH值采用美国哈希水质分析仪检测，剩余指标分别使用试剂AmVerTM High Range Ammonia Reagent Set 2606945（0～50 mg/L）、NitriVer3亚硝酸盐试剂、硫化物试剂盒、Total Nitrogen Hydroxide Reagent Set 2671745（0～25 mg/L）、Calcium Indicaator Solution for Low Range Colorimetric Hardness Test等进行检测。

1.2.3水体和对虾肠道微生物菌群分析取各塘口底层水样50 mL，0.22 μm滤膜过滤，收集滤膜于-80 ℃保存;另将收集的对虾解剖后，取肠道于 -80 ℃ 保存。将样品送至上海生工生物科技有限公司进行核酸抽提、16S rDNA建库和高通量测序。

1.2.4数据统计及分析对全部样品的 Effective tags进行聚类，以97%的一致性将序列聚类成OTUs。根据OTUs聚类结果，对每个OTU的代表序列做物种注释，得到对应的物种信息，根据物种注释结果，选取每个样品在门、纲、目、科、属5个分类级别上最大丰度排名前15的物种，生成物种相对丰度柱形累加图。分别统计各养殖水体的所有样品中均存在的OTU，并进行统计学分析。另水质数据采用“平均值±標准差”表示，采用 SPSS 11.0 对试验数据进行统计分析，P<0.05 时被认为具有显著性差异。

2结果

2.1水质指标变化

从养殖20 d开始，至养殖48 d为止，监测塘水温、pH值、溶解氧、氨氮、亚硝酸盐、硫化氢、总氮、总磷、化学需氧量和钙离子等指标变化情况。由表1可知，水温变化区间为25.8～29.7 ℃，平均水温27.7 ℃;pH值变化区间为8.11～9.06，平均pH值8.52;溶解氧浓度的变化区间为4.30～10.89 mg/L，平均浓度为8.93 mg/L。

另由表1可知，氨氮、硫化氢、钙离子和水体中的总氮和总磷随养殖时间增加出现明显上升：氨氮从养殖20 d时的0.26 mg/L升高至41 d时的 1.18 mg/L（P<0.05），随后下降至0.75 mg/L;硫化氢从养殖20 d时的0.07 mg/L升高至41 d时的0.12 mg/L（P<0.05），随后下降至0.06 mg/L;钙离子持续上升，从养殖20 d时的6.10 mg/L升高至 41 d 時的31.44 mg/L（P<0.05）;总氮和总磷持续上升，总磷从养殖 20 d 时的0.39 mg/L升高至 0.52 mg/L（P<0.05）;总氮也从3.20 mg/L升高至4.90 mg/L（P<0.05）。

2.2水体微生物菌群变化

由图1可知，菌群分析结果显示，该监测点水体中的微生物分属于53纲，主要微生物菌群包括蓝藻细菌纲、α-变形菌纲、β-变形菌纲、γ-变形菌纲-弧菌、放线菌纲、酸微菌纲、绿藻纲、Δ-变形菌纲、鞘脂杆菌纲、暖绳菌纲、黄杆菌纲和绿菌纲12个纲，整个监测周期内合计占总微生物群体的比例达到79.62%，其他微生物占比20.38%。

由表2和图2可知，蓝藻细菌纲微生物占比最多，平均占比17.72%，高峰时占比达23.81%，其次为 α-变形菌纲、β-变形菌纲和γ-变形菌纲（弧菌科），占比分别达12.23%、9.33%和7.98%。水体中蓝藻细菌纲、γ-变形菌纲-弧菌、暖绳菌纲、Δ-变形菌纲和鞘脂杆菌纲微生物随着养殖时间推移，占比均有不同程度增加，其中，蓝藻细菌纲微生物群占比从养殖20 d时的10.40%上升至41 d时的23.81%;γ-变形菌纲-弧菌微生物群占比则从743%上升至10.05%;暖绳菌纲微生物群占比从1.25%上升至7.69%;Δ-变形菌纲微生物群占比从2.79%上升至5.15%;鞘脂杆菌纲微生物群占比从2.37%上升至6.84%。暖绳菌纲微生物群波动最大，其占比变化区间为0.12%～1.75%，最高值为最低值的14.82倍，其次分别为暖绳菌纲、鞘脂杆菌纲、黄杆菌纲、放线菌纲、绿藻纲、蓝藻纲、β变形菌纲、酸微菌纲、Δ-变形菌纲和α变形菌纲，而 γ-变形菌纲-弧菌占比变化最小，其变化区间为684%～1005%，最高值为最低值的1.47倍。

2.3对虾肠道微生物菌群变化

由图3可知，该监测点对虾肠道中的微生物分属于42纲，主要微生物菌群包括γ-变形菌纲-弧菌、杆菌纲、β-变形菌纲、黄杆菌纲、α-变形菌纲、梭菌纲和蓝藻细菌纲7个纲的微生物群，合计占总微生物群体的比例达80.62%，其他微生物占比1938%。

由表3和图4可知，γ-变形菌纲-弧菌占比最多，平均占比26.35%，高峰时占比达46.24%，其次为杆菌纲和β-变形菌纲，占比分别达15.28%和14.48%。对虾肠道中γ-变形菌纲-弧菌、α-变形菌纲和蓝藻细菌纲微生物随养殖时间推移，占比均有不同程度的增加，其中，γ-变形菌纲-弧菌微生物群从养殖20 d时的26.79%上升至34 d时的4624%;α-变形菌纲微生物群从养殖20 d时的211%上升至41 d时的12.31%，随后下降至539%;蓝藻细菌纲微生物群从养殖20 d时的038%上升至48 d时的7.42%。蓝藻细菌纲微生物群波动最大，其占比变化区间为0.38%～742%，最高值为最低值的19.53倍，其次分别为梭菌纲、β-变形菌纲、α-变形菌纲、黄杆菌纲和γ-变形菌纲-弧菌，而杆菌纲微生物群占比变化最小，其变化区间为558%～10.72%，最高值为最低值的1.92倍。

3讨论

凡纳滨对虾由于生活于水体环境中，与水体中的微生物群及水体物理环境直接接触，因此两者变化极易影响凡纳滨对虾的健康状态。由于近年来抗生素、水质调节剂及微生态制剂滥用，导致水体微生态环境紊乱、水生动物疾病频发。

本研究对浙江某凡纳滨对虾养殖场对虾养殖至20 d后虾塘的水质、水体及虾体微生态菌群进行检测，了解疾病高发期水体及虾体中微生态菌群的变化规律。王兴强等研究发现，凡纳滨对虾在pH值为7.5～8.5、溶解氧含量为6.8 mg/L的水体中生长较好，溶解氧含量低于4 mg/L则会限制对虾的生长[12]。本研究中，养殖20～48 d内，水体中的水温和pH值均较为稳定，平均水温和pH值分别为27.7 ℃和8.52，而溶解氧最低浓度为4.30 mg/L，平均浓度为 8.93 mg/L，虽然没有一直维持在最适范围内，但基本能保证对虾正常生长[13]。而氨氮、硫化氢、钙离子和水体中的总氮和总磷含量随着养殖时间增加出现显著上升，最高时分别上升至118、0.12、31.44、052、4.90 mg/L，较最低的时候分别上升4.54、1.71、5.15、1.50、1.30倍，这与养殖户投喂情况相关，随养殖期的发展，水体中残余饲料、排泄物、浮游动物尸体等有机物逐渐增多不断分解使得COD不断增高，相应的水体中的有机物分解产物，如氨氮、亚硝酸盐等有害物质含量均会明显上升，并会对幼虾及成体虾造成毒害[14-15]。

菌群分析结果显示，对虾养殖塘水体中的微生物菌群分属于53纲，主要种类有12纲，合计占总微生物群体的比例达79.62%，其中蓝藻细菌纲微生物占比最多，平均占比17.72%，高峰时占比达2381%，其次为α-变形菌纲、β-变形菌纲和γ-变形菌纲（弧菌科），占比分别达到12.23%、9.33%和798%。该结果与之前同类研究类似，罗鹏等研究发现凡纳滨对虾养殖水体细菌群落结构复杂，以变形菌纲类微生物群为主，其中又以α-变形菌纲、β-变形菌纲和γ-变形菌纲（弧菌科）为主[16];Zeng等学者也发现变形菌纲为水体中最主要的细菌类群[17-18]。本研究还发现，水体中的蓝藻细菌纲微生物群占比较高，其占比甚至高于变形菌纲微生物群，这与水体富营养化严重导致的蓝藻泛滥有关[17-18]。随养殖时间推移，水体中的微生物菌群也有一定变化，其中蓝藻细菌纲和γ-变形菌纲-弧菌微生物群变化最为明显，分别从10.40%和743%上升至23.81%和10.05%，这可能与水体中水质指标变化有关，后期养殖水体中的总氮、总磷等营养盐均有明显上升。此外，暖绳菌纲微生物群波动最大，其占比变化区间为0.12%～1.75%，最高值为最低值的14.82倍，而γ-变形菌纲-弧菌波动最小，最高值为最低值的1.47倍，说明弧菌在水体中较为稳定，数量变化不如其他微生物群容易受环境变化的影响。

而虾体肠道中的微生物分属于42纲，主要种类有7纲，合计占总微生物群体的比例达到80.62%，其中，γ-变形菌纲-弧菌占比最多，平均占比2635%，说明γ-变形菌纲-弧菌是凡纳滨对虾肠道中的主要微生物菌群，其次为杆菌纲和β-变形菌纲。这与之前的研究结果类似，如Beardsley、Liu和Rungrassamee等研究均表明，γ-变形菌纲在对虾肠道内占绝对优势，且弧菌属、气单胞菌属为绝对优势属，且随着养殖时间增加，肠道中的变形菌纲和蓝藻细菌纲微生物菌群占比均有显著增加[19-21]。不过也有部分研究发现，γ-变形菌纲并非对虾肠道优势菌群，如Tang等分析发现了凡纳滨对虾肠道细菌种群，放线菌门、未分类细菌门、变形菌门和拟杆菌门是优势菌门，分别占比为53.5%、22.4%、188%和4.32%。所以不同品种的蝦，由于生活环境的差异，可能导致肠道定殖的细菌种类存在差异[22]。

总结本研究发现，随着养殖时间增加，饲料投喂量增加，水体中的氨氮、硫化氢、钙离子、总氮和总磷等指标会出现显著上升。养殖塘中的主要微生物群为蓝藻细菌纲和变形菌纲类细菌，且蓝藻细菌纲和γ-变形菌纲-弧菌微生物群到养殖后期数量显著上升;对虾肠道中的主要微生物群为γ-变形菌纲-弧菌，在养殖中期有显著上升。

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