基于网络药理学探讨含石菖蒲高频药对抗癫痫机制*

王坤芳，祝娜，沙子珺，朱彦，梁志刚，牛文晶，杨育同

1.山西中医药大学，山西 晋中 030619；2.中央民族大学，北京 100081；3.中国中医科学院中医药信息研究所，北京 100700；4.山西中医药大学附属医院，山西 太原 030024

癫痫是由多种病因引起的一种慢性脑部疾病，是脑内神经元过度放电导致的反复性、发作性、短暂性的中枢神经系统功能异常［1］。流行病学调查发现，我国癫痫患病率在7‰，约有900万癫痫患者，且每年有40万的新发患者［2］。癫痫的反复发作严重影响患者的生活质量。癫痫患者的死亡风险为一般人的2～3倍［2］。目前，癫痫治疗仍以药物控制发作为主，共开发了7种传统的抗癫痫药（antieptic drugs，AEDs），以卡马西平、丙戊酸为代表药及多种新型的AEDs，以拉莫三嗪、奥卡西平、托吡酯等为代表药。但很多AEDs均会产生严重程度不一的不良反应，如认知障碍、嗜睡、头晕、共济失调、记忆下降等中枢神经系统不良反应，还会出现白细胞下降、皮疹等其他系统表现。

癫痫属于中医“痫病”“痫症”范畴。中医学认为，癫痫病因与七情失调、先天因素、脑部外伤有关。病因中尤以痰邪作祟最为首要，痰浊内阻、阴阳偏盛、神机受累、元神失控是病机关键所在［3］。中药治疗癫痫已有多年的历史，同时抗癫痫有低毒长效的优势［4］。石菖蒲（Acorustatarinowii Schott）为天南星科植物石菖蒲的干燥根茎，具有开窍醒神、化湿和胃、宁神益智的功效。《神农本草经》记载石菖蒲能“开心孔，补五脏，通九窍，明耳目，出音声”；《本草纲目》中记载该药可治中恶卒死、客杵癫痫、下血崩中等。现代药理研究证实，石菖蒲有抗癫痫的作用［5］。许多典籍中记载的含石菖蒲方剂，其中蕴含了大量的有效中药药对或组合，对石菖蒲配伍规律及组合物的挖掘，有利于石菖蒲抗癫痫新药的发现。本研究拟采用关联规则数据挖掘结合网络药理学的方法，从“中药-化学成分-疾病-靶标-通路”角度进行分析，探究石菖蒲及其配伍组合治疗癫痫的分子作用机制。

1 材料与方法

1.1 处方来源与纳入标准在中国中医科学院中医药信息研究所中国中医药数据库方剂数据库中以“石菖蒲”为主题词［6］，对含石菖蒲的方剂进行检索。纳入标准：1911年前古代医籍所记载的方剂。根据《古代经典名方目录制定的遴选范围与遴选原则》第一条，关于古代医籍的遴选范围界定为：1911年前出版的古代医籍。

排除标准：非内用方剂、单味药方剂、方剂中药物组成不确切的方剂。参考《中华人民共和国药典》《中药大辞典》对中药名称进行规范化处理，筛除剂量、药物炮制信息、描述性前缀词，保留个别炮制信息。

1.2 含石菖蒲高频药对的数据挖掘运用统计分析软件R（V3.4.0）语言的arules包，对含石菖蒲的方剂进行关联规则（association rules）分析，以获得石菖蒲高频对药。结果按支持度、置信度降序排列，设置筛选条件：提升度≥1、支持度≥0.3、置信度≥0.9，认为同时满足支持度≥0.3、置信度≥0.9的高频对药具有强关联规则性［6］。

1.3 含石菖蒲及其高频药对网络药理学研究

1.3.1 化学成分的获取与筛选 分别以“石菖蒲”“远志”“人参”和“茯苓”为关键词，通过中药系统药理学数据库和分析平台（traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）和中国科学院上海有机化学研究所化学专业数据库搜集石菖蒲及其高关联对药所含化学成分。利用Pubchem数据库获得化合物的Canonical SMILES格式。将化合物的SMILES格式文件导入SwissADME平台，设置胃肠道吸收性（GI absorption）以及血脑屏障渗透性为High，Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge类药性（Druglikeness）预测结果中有2个或以上为“YES”的化学成分为潜在活性成分。

1.3.2 抗癫痫靶点预测 通过TCMSP数据库搜集化合物作用的靶点；通过Swiss Target Prediction平台，导入筛选所得化合物的SMILES格式文件，设置属性为“homo sapiens”，预测化合物作用的潜在靶点。以“epilepsy”关键词，通过OMIM 与DrugBank疾病靶点网站进行检索，获得癫痫的疾病靶点，并应用UniProt数据库对疾病靶点进行标准化。将药物靶点与疾病靶点分别剔除重复项后，通过STRING数据库（https：//string-db.org/）分别构建化合物对应靶点的PPI网络及疾病对应靶点的PPI网络。应用Cytoscape3.7.0软件“Merge”功能获取药物-疾病交集靶点，将其作为石菖蒲及其药对抗癫痫的潜在作用靶点。

1.3.3 生物过程与通路富集分析 将交集靶点提交DAVID数据库，设置为“Homo sapiens”，设置“COUNT”为2，“EASE”为0.05，进行GO注释分析和KEGG通路富集分析。

1.3.4 抗癫痫“成分-靶点-通路”网络图的构建 采用Cytoscape3.7.0软件构建石菖蒲及其对药抗癫痫的“活性成分-靶点-通路”网络模型，网络包括潜在活性成分、靶点或作用通路3类节点，并以浅相连。

2 结果

2.1 关联分析从806首含石菖蒲方剂中筛选出743首符合要求的标准方剂，同时符合提升度、支持度、可信度关联规则筛选条件的对药共4对，与石菖蒲密切相关的中药依次是远志、人参、甘草、茯苓，且远志＝＞石菖蒲、人参＝＞石菖蒲、甘草＝＞石菖蒲、茯苓＝＞石菖蒲均具有强关联规则性，见表1。

2.2 石菖蒲及其高频对药活性成分筛选结果通过TCMSP数据库和化学专业数据库共收集到295个石菖蒲及其高频对药相关化合物，通过胃肠道吸收性、类药性筛选的化合物为159个，同时还具有血脑屏障渗透性的化合物为112个。其中包括50个石菖蒲相关成分、13个远志相关成分、44个人参相关成分和5个茯苓相关成分，见表2，图1。

表1 含石菖蒲药对关联规则筛选结果

表2 含石菖蒲方剂活性成分

续表2 含石菖蒲方剂活性成分

图1 含石菖蒲方剂活性成分BOILED-Egg图

2.3 含石菖蒲及其药对-疾病-靶点网络利用TCMSP数据库和Swiss Target Prediction平台共获取762个药物潜在靶点。通过OMIM 与DrugBank数据库共搜集到489个疾病相关靶点。分别构建化合物对应靶点的PPI网络及疾病对应靶点的PPI网络，经Cytoscape软件“Merge”获得石菖蒲方剂抗癫痫的特征性基因共89个，返回STRING数据库构建“药物-疾病”交集靶点PPI网络图，见图2。

图2 含石菖蒲及其药对-疾病-靶点网络图

图3 含石菖蒲方剂抗癫痫特征性基因GO功能富集分析

2.4 基因功能和通路富集结果通过DAVID数据库对石菖蒲方剂抗癫痫的特征性基因进行GO功能富集分析，获得生物过程（biological process，BP）相关条目227个，主要涉及信号传导、离子跨膜转运、化学突触传递、胆碱能突触传递等方面；细胞组成（cellularcomponent，CC）相关条目47个，主要涉及质膜、突触后膜、树突、线粒体等部位；分子功能（molecular function，MF）相关条目41个，主要涉及细胞外配体门控离子通道活性、GABA-A受体活性、苯二氮卓受体活性、G蛋白偶联受体活性、乙酰胆碱受体活性等方面。GO功能富集分析结果中各分类Count值前10的相关条目，图3。通过DAVID数据库进KEGG通路富集分析结果显示，石菖蒲及其高频对药抗癫痫的特征性基因共涉及36条通路，主要涉及神经配体受体相互作用、GABA能突触、钙信号通路、cAMP信号通路、多巴胺能突触、5-羟色胺能突触等，见表3，图4。

2.5 含石菖蒲及其高频对药抗癫痫“成分-靶点-通路”网络图利用Cytoscape3.7.0软件对石菖蒲及其高频对药的112个活性成分、具有抗癫痫作用的89个特征性靶点、Count值前10的信号通路进行“成分-靶点-通路”网络的构建，见图5。说明石菖蒲及其高频对药治疗癫痫有“多成分-多靶点-多途径”的作用特点。

表3 含石菖蒲抗癫痫特征性基因KEGG通路富集分析

图4 含石菖蒲抗癫痫特征性基因KEGG通路富集分析

图5 含石菖蒲方剂抗癫痫的“成分-靶点-通路”网络图

3 讨论

基于数据挖掘对治疗癫痫的118个方剂中所含157种药物的用药规律进行分析，发现石菖蒲使用频次最高［7］。药对又称对药，是临床用药中相对固定的两味药物的配伍形式，具有复方配伍的最基本特点［8］。药对是临床方剂应用的灵魂，是方剂有效性的关键［9］。故采用数据挖掘及网络药理学相结合的方法对石菖蒲抗癫痫高频药对及其可能作用机制进行探讨。

此次研究中，远志、人参、甘草、茯苓与石菖蒲关联度最高，其中除甘草外，四味药与《外台秘要》中的定志丸相同。通过文献调查，发现以定志丸为基本方加减，常用于治疗癫痫［10-11］。石菖蒲、远志合用祛痰化湿、开窍醒神益智，人参、茯苓合用益气健脾、宁心复脉安神。痫证的中医病理因素涉及风、火、痰、瘀，其中尤以痰邪作祟最为重要，定志丸恰恰通过祛痰化湿、宁心安神治疗癫痫。甘草与石菖蒲的强关联性可被认为是甘草常被作为使药用于多数方剂的结果，故予以剔除。

网络药理学分析结果显示，石菖蒲及其高频对药抗癫痫主要与胆碱能突触传递、神经配体受体相互作用、GABA能突触、钙信号通路、cAMP信号通路、多巴胺能突触、5-羟色胺能突触等生物过程及信号通路有关，涉及细胞外配体门控离子通道活性、GABA-A受体活性、苯二氮卓受体活性、G蛋白偶联受体活性、乙酰胆碱受体活性等分子过程，主要作用于质膜、突触、线粒体等部位。癫痫的发病机制复杂，目前仍未完全阐明，普遍接受的学说是中枢神经系统兴奋与抑制的失衡。近年的研究表明，癫痫发病机制与离子通道、神经突触递质与受体、神经胶质细胞及一些免疫反应等发生不平衡相关［12］。多数学者研究发现，氨基酸类递质γ-氨基丁酸（GABA）和单胺类递质多巴胺、5-羟色胺能够抑制癫痫发作，而乙酰胆碱则能促进癫痫发作［13］。应用基因芯片技术检测难治性颞叶内侧型癫痫患者的硬化海马组织与正常海马组织基因差异表达，结果显示，差异基因涉及的通路有神经活性配体、受体相互作用通路和钙离子信号通路［14］，与本研究结果相符，推测石菖蒲及其高频对药可能是通过作用于突触来调控上述通路，从而发挥抗癫痫作用。

在CNKI中以“石菖蒲”和涉及的相关通路为主题词检索，发现“石菖蒲”与“GABA”检索时所得文献数量最多，为21篇。GABA是中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，它参与人体多种代谢活动，具有较高的生理活性。当人体内GABA缺乏时，会产生焦虑、不安、疲倦、忧虑等情绪。相关研究表明，石菖蒲所含成分α-细辛醚可以通过调控GABA-A型受体来抑制小鼠嗅球内僧帽细胞的自发放电，并能阻滞Nav1.2离子通道使膜电位超级化，从而缓解动物惊厥症状［15］。石菖蒲中的桉脂素（SCP15）能够通过上调小鼠和大鼠脑部GABA-A型受体的表达而对抗电击和戊四氮诱导的癫痫［16］。药对配伍实验研究显示，人参、石菖蒲配伍后安神益智的功效远胜于单用人参或石菖蒲，其机制与改善睡眠剥夺动物的脑内神经递质ACh、GABA有关［17］。故进一步推测，含石菖蒲药对抗癫痫的作用机制很有可能与调节GABA有关，为进一步研究提供参考。

综上所述，本文运用网络药理学的方法，从含石菖蒲方剂中获取112个活性成分，挖掘出其治疗癫痫的89个特征性基因靶点，涉及到多个信号通路及生物进程，初步探索了含石菖蒲方剂治疗癫痫的分子网络调控机制，体现了含石菖蒲方剂通过多成分-多靶点-多通路治疗癫痫症状的特点，该结果可为癫痫的防治提供研究思路，但其具体机制还有待进一步研究。另外，由于数据检索过程未考虑方剂中石菖蒲、远志、茯苓与人参的配比、用药剂量、给药途径等问题，本文研究结果还有待开展药效及分子机制实验进行验证。