延胡索提取物抗痛风作用

张旭 张权铭 董睿陶 王托

(1长春医学高等专科学校临床医学部，吉林 长春 130013；2长春市十一高中；吉林大学 3生命科学学院；4药学院)

痛风是一种关节炎症疾病，伴随有严重的关节红肿、发热和疼痛〔1〕。临床上将血尿酸(UA)水平持续高于6.8 mg/dl定义为高尿酸血症，也被认为是痛风发病的重要病理基础〔1,2〕。基于痛风的病理特征，痛风的治疗策略可分为解热镇痛和降低UA两类〔3,4〕。解热镇痛作用药物主要应用于痛风性关节炎急性发作期，仅能暂时缓解或抑制痛风的症状〔5〕。持续降低UA水平可有效防止痛风性关节炎的发作，因此有研究者认为，降低UA才是痛风治疗的根本〔6〕。目前市场上的痛风药物，如秋水仙碱、别嘌呤醇等，均伴随有恶心、呕吐、腹泻等毒副作用，且作用效果单一〔4,7,8〕。临床治疗中急需一种安全性高，且既能发挥解热镇痛作用又能降低UA水平的痛风治疗手段。延胡索是植物延胡索的块茎，其镇痛作用已受到广大医者的认同〔9〕。目前从延胡索中分离得到了多种活性生物碱成分，包括延胡索乙素、去氢紫蓳碱等20多种，展现了镇痛、抗菌、抗肿瘤等多种生物活性〔9〕。机体中黄嘌呤氧化酶(XOD)等催化嘌呤代谢产生UA的过程中，伴随有大量活性氧(ROS)的产生。过量ROS不仅会引起组织氧化损伤，而且促进了痛风发作过程中的炎症因子产生释放过程〔10,11〕。目前关于延胡索在痛风疾病领域的应用研究几乎没有，其降低血液UA的作用仍有待确定。本研究建立高尿酸血症小鼠模型，拟分析延胡索提取物(YHS)降UA活性及其对痛风发作过程可能的调节作用。

1 材料与方法

1.1动物 SPF级雄性BALB/c小鼠，8周龄，体重18～20 g，购自辽宁长生生物制品有限公司，许可证号：SCXK(辽)2015-0001。

1.2主要试剂 延胡索块茎(河北省安国市瑞琪中药材有限公司)，别嘌呤醇片(世茂天街药业有限公司)，红细胞裂解液和细胞染色缓冲液(赛默飞世尔公司)，UA测定试剂盒和XOD测定试剂盒(Sigma-Aldrich)，ROS，丙二醛(MDA)，超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，过氧化氢酶(CAT)，白细胞介素(IL)-1β，肿瘤坏死因子(TNF)-α，IL-8，单核细胞趋化蛋白(MCP)-1等酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(江苏科特生物科技有限公司)。

1.3主要仪器 可调式微量移液器(10～100 μl，100～1 000 μl，Eppendorf公司)；电子天平(BP221S，德国赛多利斯)； 多功能酶标(SynergyTM4，BioTek公司)；超净工作台(VS-1300V，苏州安泰空气技术有限公司)；恒温水浴锅(GSY-Ⅱ，北京市医疗设备厂)；大容量冷冻离心机(5810R，Eppendorf公司)；真空冷冻冻干机(HLPHA-1-4，Christ公司)；流式细胞仪(Cytoflex，贝克曼公司)。

1.4YHS给药溶液制备 取延胡索干燥品经初步粉碎产物100 g加入1 L去离子水混合均匀，100℃加热2 h，6 000 r/min离心取上清，上清液经冷冻干燥后即为YHS。2 g、4 g和8 g延胡索干燥品提取获得的等量提取物分别溶于10 ml去离子水中即得YHS低剂量(L)、中剂量(M)、高剂量(H)给药溶液。

1.5模型建立及给药 60只雄性健康BALB/c小鼠，经适应性喂养1 w后，随机分为空白对照组、模型组、别嘌呤醇阳性组(AL)、YHS-L组、YHS-M组和YHS-H组各10只，AL小鼠给药20 mg/kg别嘌呤醇，YHS-L、YHS-M和YHS-H小鼠分别给药相应给药溶液(等同于2 g/kg、4 g/kg和8 g/kg延胡索)。对照组和模型组小鼠灌胃等体积去离子水。给药方式为灌胃给药，给药体积为10 ml/kg，连续给药14 d。在最后3 d灌胃给药1 h前，除去对照组小鼠，其余小鼠腹腔注射氧嗪酸钾生理盐水溶液(300 mg/kg)进行高尿酸血症建模，对照组小鼠注射等体积生理盐水。

1.6小鼠外周血免疫细胞检测 小鼠最后一次灌胃给药2 h后，眼底静脉丛取血，分取100 μl血液，加入红细胞裂解液2 ml混合均匀避光5 min后，1 200 r/min离心5 min，弃上清，沉淀用200 μl细胞染色缓冲液重悬，进行流式细胞术测定。

1.7小鼠血液及组织采集 小鼠最后一次灌胃给药2 h后，眼底静脉丛取血，室温放置30 min，3 000 r/min离心10 min取上清即得小鼠血清，取血后小鼠通过二氧化碳吸入法安乐死。收集小鼠肾脏和肝脏，小鼠肾脏用10%甲醛固定，肝脏和血清-80℃保存备用。

1.8小鼠肾脏病理学检测 小鼠肾脏固定7 d后，经过50%、75%、80%、90%、100%乙醇溶液、二甲苯、二甲苯的顺序进行脱水透明后，进行石蜡包埋。将小鼠肾脏石蜡块切成5 μm的组织切片后，经过100%、90%、80%、75%、50%乙醇复水处理后，进行苏木素-伊红(HE)染色，封片后在显微镜200倍放大倍数下进行观察。

1.9小鼠血清UA及XOD测定 使用UA检测试剂盒和XOD检测试剂盒测定。

1.10小鼠氧化应激相关因子及炎症相关因子测定 使用ELISA测定小鼠血清和肝脏中ROS、MDA、SOD、GSH-Px和CAT含量，小鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-8、MCP-1含量。

1.11统计学方法 采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)及Dunn多重比较检验。

2 结 果

2.1YHS对高尿酸血症小鼠UA及XOD含量的影响 与对照组相比，模型组血清UA水平，血液和肝脏中XOD活性显著升高(P<0.01)，AL组显著降低(P<0.05)。与AL组比较，YHS给药组UA水平和XOD活性显著升高(P<0.05)，且YHS的作用效果呈现剂量依赖性增强。见表1。

表1 YHS对高尿酸小鼠血UA及XOD 的影响

2.2YHS对高尿酸血症小鼠氧化应激水平的影响 与对照组相比，模型组ROS水平显著升高(P<0.01)，SOD和GSH-Px水平显著降低 (P<0.05)。与模型组比较，YHS-H组ROS水平显著降低，SOD、GSH-Px、CAT水平显著升高(P<0.05,P<0.01)。AL组ROS水平显著低于模型组(P<0.05)，见表2。

表2 YHS对高尿酸小鼠氧化应激相关因子的影响

续表2 YHS对高尿酸小鼠氧化应激相关因子的影响

2.3YHS对高尿酸血症小鼠肾脏病理的影响 与对照组相比，模型组小鼠肾脏肾小球间隙明显增大，肾小球出现一定程度的不规则形变。YHS-M、YHS-H组小鼠肾小球病例变化得到缓解，肾小球间隙明显缩小。见图1。

图1 YHS对高尿酸小鼠肾脏病理学影响(HE，×200)

2.4YHS对高尿酸血症小鼠炎症相关因子的影响 与对照组相比，模型组血清中IL-1β和TNF-α水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较，YHS-H组IL-1β显著降低，AL组、YHS-L、M、H组TNF-α水平显著降低(均P<0.01)；YHS-L组IL-8水平显著降低(P<0.05)，见表3。

表3 各组炎症因子比较

2.5YHS对高尿酸血症小鼠外周血细胞的影响 与对照组相比，模型组小鼠外周血中性粒细胞比例增加了15.0%以上，YHS-M、YHS-H组比例减少了13.0%以上。YHS降低高尿酸血症小鼠外周血中中性粒细胞的作用效果呈现剂量依赖性增强。见图2。

图2 YHS对高尿酸小鼠外周血中中性粒细胞的影响(P2中性粒细胞，P3单核细胞，P4淋巴细胞)

3 讨 论

天然产物以其生物相容性高、活性广泛、毒副作用小等特点，成为新药开发的重要来源，受到越来越多研究者的关注。延胡索是传统中医中药中经典的镇痛作用药物，现代药学研究从延胡索中分离获得的延胡索甲素、延胡索乙素等有效成分均显示了很好的镇痛作用〔9〕。高尿酸血症作为痛风发病的基础，其本身并不会有明显的发病症状。高尿酸血症的危害主要在于其引起的痛风、心脑血管疾病、肾脏损伤、糖尿病等并发症，在这一过程中氧化应激损伤起到了很大作用〔12〕。在痛风发作过程中，中性粒细胞的募集及炎症因子IL-1β等的释放使患者患处疼痛、发热及炎症反应的生理生化基础〔13,14〕，氧化应激可有效激活NL3，促进IL-1β释放〔15〕。通过抑制中性粒细胞数量，降低氧化应激水平，抑制炎症因子，可有效抑制痛风的发作。

本研究结果说明YHS不仅缓解了高尿酸血症的症状，而且抑制了痛风发作过程中重要的生理生化变化。本文证实了延胡索具有成为痛风治疗药物的潜力，为延胡索作为抗痛风药物的进一步开发提供科学基础。