miR-29a-3p靶向组蛋白去乙酰化酶4对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的影响

徐艳梅 黄杰 熊艳 许琛 汪磊 赵夏 张璐璐 许传文

(华中科技大学同济医学院附属普爱医院肾内科,湖北 武汉 430030)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病常见并发症并可导致终末期肾衰竭，其发病机制较为复杂，既往研究显示炎症介质释放、细胞凋亡及氧化应激等均可通过破坏肾小球过滤屏障进而引发DN〔1〕。足细胞又称为肾球脏层上皮细胞，具有合成肾小球基底膜主要成分及维持肾小球过滤屏障完整性等功能，研究发现肾小球足细胞损伤可能是导致DN发生及发展的主要因素〔2〕。因此寻找有效治疗及防止足细胞损伤的方法成为亟待解决的问题。研究表明，高糖可显著下调体外培养的人近端肾小管上皮细胞中微小RNA(miR)-29a的表达，高糖可通过下调miR-29a进而造成基质胶原聚集最终导致DN〔3〕。急性肾损伤患者血清中miR-29a表达水平降低，过表达miR-29a能抑制肾小管上皮细胞凋亡〔4〕。在糖尿病小鼠中，miR-29表达下调，过表达miR-29能够抑制高糖环境导致的肾小管上皮细胞的损伤〔5〕。通过生物信息学软件预测miR-29a-3p与组蛋白去乙酰化酶(HDAC)4的 3′UTR存在结合位点，研究显示HDAC4在STZ诱导的DN大鼠模型的肾脏中表达显著增加，同时体外实验显示高糖刺激能诱导足细胞HDAC4的表达〔6〕。但miR-29a-3p靶向HDAC4对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的影响未见相关研究。本研究通过高糖诱导小鼠足细胞MPC5模拟DN环境，探讨miR-29a-3p对高糖诱导损伤MPC5细胞的影响，并验证其与HDAC4的靶向关系，为临床靶向治疗DN提供理论依据。

1 材料与方法

1.1细胞与试剂 小鼠肾脏足细胞系MPC5购自上海康朗生物科技有限公司。DMEM培养基、胰蛋白酶及胎牛血清均购自上海沪峰生物科技有限公司；miR-29a-3p mimic及阴性转染质粒、miR-29a-3p抑制剂(anti-miR-29a-3p)、anti-miR-NC均购自上海吉玛有限公司；si-HDAC4、阴性对照siRNA(si-NC)、HDAC4过表达质粒(pcDNA-HDAC4)与空白对照空质粒(pcDNA)均购自广州锐博生物科技有限公司；实时荧光定量试剂盒、反转录试剂盒及Trizol试剂均购自美国Life Technology公司；细胞凋亡检测试剂盒及脂质体Lipofectamine2000转染试剂盒均购自杭州吉诺生物医药技术有限公司；兔抗鼠HDAC4一抗购自美国Protein Tech Group公司；兔抗鼠结蛋白(desmin)抗体、兔抗鼠Bcl-2、Bax、酶切caspase-3多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司；兔抗鼠synaptopodin抗体、GAPDH及辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG均购自北京博奥森公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养、转染及分组 MPC5细胞复苏，放入DMEM培养基，培养基主要成分为体积分数10%胎牛血清、青霉素(100 kU/L)、链霉素(100 mg/L)及γ-干扰素(10 kU/L)，在温度37℃、5%CO2培养箱中进行培养，第2天更换为不含γ-干扰素的DMEM培养基培养，培养10～14 d后收集细胞用于后续实验〔7〕。收集成熟MPC5细胞接种于培养瓶(25 cm2)中，密度为5×108/L，待细胞生长融合至70%～80%时更换为不含胎牛血清的DMEM培养基，饥饿处理24 h，随机分为正常对照(NG)组、高糖刺激(HG)组，其中NG组中加入D-葡萄糖5 mmol/L；HG组中加入D-葡萄糖30 mmol/L〔8〕。收集HG组对数生长期MPC5细胞并接种于6孔细胞培养板，待细胞融合度至90%时参照Lipofectamine2000转染试剂盒说明书进行miR-29a-3p mimic、miR-NC细胞转染，si-HDAC4、si-NC转染至MPC5细胞中，转染6 h后更换新鲜培养基，继续培养48 h收集细胞用于后续实验。

1.2.2qRT-PCR法检测MPC5细胞中miR-29a-3p及HDAC4 mRNA表达 参照Trizol提取试剂盒说明书提取各组MPC5细胞总RNA，利用紫外分光光度计检测RNA浓度、纯度，RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增，miR-29a-3p及HDAC4 引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR扩增反应条件为95℃ 5 min循环1次，95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循环40次。miR-29a-3p以U6为内参基因，HDAC4以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算miR-29a-3p及HDAC4 mRNA相对表达量。

1.2.3Western印迹法检测MPC5细胞中HDAC4、synaptopodin、desmin、Bcl-2、Bax及酶切caspase-3蛋白表达 收集各组MPC5细胞，裂解蛋白后提取细胞总蛋白，利用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，分别取40 μg蛋白经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，结束后将蛋白凝胶转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%BSA脱脂奶粉封闭，30 min后分别加入蛋白一抗，置于4℃孵育过夜，次日使用TBST洗膜，分别加入二抗，室温下孵育2 h，TBST洗膜，使用增强型化学发光试剂(ECL)显影，各蛋白均以GAPDH为内参基因，放入凝胶成像系统分析仪并采用Quantity One软件分析各蛋白条带灰度值。

1.2.4流式细胞术检测MPC5细胞凋亡 分别取各组MPC5细胞，胰蛋白酶消化后收集细胞，预冷磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞，1 200 r/min转速离心5 min(离心半径 6 cm)，弃PBS，加入结合缓冲液，重悬细胞，分别加入Annexin V-FITC(5 μl)、PI(1 μl)，使用流式细胞仪检测MPC5细胞凋亡情况并利用Flowjo软件计算细胞凋亡率。

1.2.5双荧光素酶报告基因实验 收集对数生长期MPC5细胞接种于24孔细胞培养板(1×105个/ml)，待细胞融合度至80%时分别将miR-29a-3p mimic、miR-NC与WT-HDAC4、MUT-HDAC4质粒转染入MPC5细胞中，继续培养48 h后检测MPC5细胞荧光强度。

1.3统计学方法 采用SPSS21.0统计学软件进行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1高糖刺激对各组肾脏足细胞MPC5中miR-29a-3p和HDAC4基因表达的影响 qRT-PCR法与Western印迹法分别检测NG组与HG组肾脏足细胞MPC5中miR-29a-3p和HDAC4基因表达，结果显示HG组肾脏足细胞MPC5中miR-29a-3p表达水平显著低于NG组(P<0.01)，而HDAC4 mRNA及蛋白表达均显著高于NG组(P<0.01)，见图1、表1。

图1 HDAC4蛋白表达

表1 高糖刺激对各组肾脏足细胞MPC5中miR-29a-3p和HDAC4基因表达的影响

2.2miR-29a-3p过表达对高糖刺激各组肾脏足细胞MPC5中synaptopodin和desmin表达的影响 将miR-29a-3p mimic、miR-NC分别转染至高糖诱导的MPC5细胞中，qRT-PCR检测结果显示HG+miR-29a-3p组MPC5细胞中miR-29a-3p表达水平显著高于HG+miR-NC组(P<0.05)，提示转染成功。Western印迹法检测MPC5细胞中synaptopodin、desmin蛋白表达，结果显示HG组MPC5细胞中synaptopodin蛋白表达明显降低(P<0.05)，miR-29a-3p mimic转染入HG组MPC5细胞中，发现HG+miR-29a-3p MPC5细胞中synaptopodin蛋白表达明显增加(P<0.05)；HG组MPC5细胞中desmin蛋白表达明显升高(P<0.05)，转染miR-29a-3p mimic后MPC5细胞中desmin蛋白表达明显降低(P<0.05)，见图2、表2。表明miR-29a-3p过表达可减缓高糖刺激肾脏足细胞损伤。

1～4：NG组、HG组、HG+miR-NC组、HG+miR-29a-3p组，下图同图2 synaptopodin和desmin蛋白表达

表2 miR-29a-3p过表达对高糖刺激各组肾脏足细胞MPC5中synaptopodin和desmin表达的影响

2.3miR-29a-3p过表达对高糖刺激肾脏足细胞MPC5凋亡的影响 流式细胞术检测miR-29a-3p过表达后MPC5细胞凋亡情况，结果显示HG组MPC5细胞凋亡率显著高于NG组(P<0.05)，miR-29a-3p过表达后HG+miR-29a-3p组MPC5细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，进一步采用Western印迹法检测细胞凋亡蛋白表达，结果发现相较于NG组，HG组MPC5细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax、酶切caspase-3蛋白表达均显著升高(均P<0.05)；与HG+miR-NC组相比，HG+miR-29a-3p组MPC5细胞中Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05)，而Bax、酶切caspase-3蛋白表达均显著降低(均P<0.05)，见图3、表3。表明miR-29a-3p过表达可抑制小鼠肾脏足细胞MPC5凋亡。

图3 miR-29a-3p过表达对高糖刺激各组肾脏足细胞MPC5凋亡蛋白的影响

表3 miR-29a-3p过表达对高糖刺激各组肾脏足细胞MPC5凋亡蛋白及凋亡率的影响

2.4抑制HDAC4表达对高糖刺激肾脏足细胞MPC5损伤的影响 为了验证HDAC4对高糖刺激肾脏足细胞MPC5损伤的影响，采用基因干扰技术抑制HDAC4表达，Western印迹法验证转染结果，HG+si-HDAC4组MPC5细胞中HDAC4蛋白表达显著降低(P<0.05)，提示基因干扰技术成功抑制HDAC4表达。通过Western印迹法检测抑制HDAC4表达后MPC5细胞中足细胞损伤及细胞凋亡相关蛋白表达，以此验证HDAC4表达变化对足细胞MPC5损伤的影响，结果显示与HG+si-NC组比较，HG+si-HDAC4组MPC5细胞中synaptopodin与Bcl-2蛋白表达均明显升高(P<0.05)，而desmin、Bax、酶切caspase-3蛋白表达均明显降低(P<0.05)，见图4、表4。说明抑制HDAC4表达可减轻高糖刺激肾脏足细胞MPC5细胞损伤，抑制MPC5细胞凋亡。

1～4：NG组、HG组、HG+si-NC组、HG+si-HDAC4组图4 HDAC4、synaptopodin、desmin及凋亡相关蛋白表达

表4 抑制HDAC4表达对高糖刺激肾脏足细胞MPC5损伤的影响

2.5miR-29a-3p靶向调控HDAC4的表达 用生物信息学软件预测HDAC4为miR-29a-3p潜在靶基因，见图5A。采用荧光素酶报告实验发现miR-29a-3p过表达可降低WT-HDAC4的荧光素酶活性(P<0.05)，而MUT-HDAC4与miR-29a-3p mimic共转染MPC5细胞其荧光素酶活性无明显变化(P>0.05)，见表5。Western印迹实验结果显示miR-29a-3p过表达后MPC5细胞中HDAC4蛋白表达水平明显下降(P<0.05)，抑制miR-29a-3p表达后MPC5细胞中HDAC4蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，见图5B、表6。

A：HDAC4的3′UTR中含有与miR-29a-3p互补的核苷酸序列；B：HDAC4蛋白表达，1～4：miR-NC组、miR-29a-3p组、anti-miR-NC组、anti-miR-29a-3p组图5 miR-29a-3p靶向调控HDAC4的表达

表5 双荧光素酶报告实验

表6 miR-29a-3p调控HDAC4蛋白的表达

2.6HDAC4过表达逆转了miR-29a-3p过表达对高糖刺激肾脏足细胞MPC5损伤的作用 构建HDAC4过表达质粒与miR-29a-3p mimic共转染入MPC5细胞，相对于HG+miR-29a-3p+pcDNA组，HDAC4过表达后，流式细胞术检测结果显示MPC5细胞凋亡率增加(P<0.05)，Western印迹检测结果显示synaptopodin与Bcl-2蛋白表达均明显降低，而desmin、Bax、酶切caspase-3蛋白表达均显著升高(P<0.05)，见表7、图6。

表7 HDAC4过表达逆转了miR-29a-3p过表达对高糖刺激肾脏足细胞MPC5损伤的作用

1～4：miR-NC组、miR-29a-3p组、miR-29a-3p+PCDNA组、miR-29a-3p+PCDNA-HDAC4组图6 HDAC4、synaptopodin、desmin蛋白及凋亡相关蛋白表达

3 讨 论

DN患者主要临床表现为微量尿蛋白，随着疾病进展会出现肾小球滤过率降低及蛋白尿恶化等，最终导致肾功能丧失，蛋白滤过最后屏障是足细胞，足细胞损伤是导致蛋白尿产生的主要原因〔9〕。研究表明DN发展为肾小球硬化及纤维化的主要原因在于足细胞凋亡，成熟足细胞持续凋亡可促使其功能发生紊乱进而产生蛋白尿〔10，11〕。Zhou等〔12〕研究显示miRNA在DN发病机制中发挥重要作用并可成为治疗DN新靶点。因此，本研究探讨DN高糖诱导足细胞损伤的机制有助于寻找防治DN的新靶点，对改善DN治疗方案及降低死亡率均具有重要意义。

miR-29a在肾脏疾病发生及发展过程中发挥重要调控作用，研究显示下调miR-29a表达可通过促进MMP-2表达进而促使肾小管间质及肾脏纤维化发生〔13～15〕。相关研究表明DN患者与1型糖尿病患者血清中miR-29a-3p表达水平降低，并可参与疾病发生及发展过程〔16，17〕。本研究结果显示高糖诱导肾脏足细胞MPC5中miR-29a-3p表达水平明显降低，说明miR-29a-3p表达水平降低可能促进MPC5损伤。通过将miR-29a-3p mimic及其阴性对照质粒转染入高糖诱导的MPC5细胞，结果发现高糖诱导的MPC5细胞中synaptopodin蛋白表达降低，上调miR-29a-3p表达后其表达水平明显上升；而desmin蛋白表达明显高于正常组，上调miR-29a-3p表达后其表达水平明显降低，其中desmin蛋白是足细胞损伤特异性和敏感指标，在足细胞损伤时表达增加；synaptopodin是成熟足细胞表型的一个重要标志蛋白，在足细胞损伤时表达减少〔18〕。提示高糖环境下miR-29a-3p表达水平降低并可造成肾脏足细胞MPC5损伤，上调miR-29a-3p表达可缓解高糖所致足细胞损伤。本研究结果发现高糖诱导的MPC5细胞凋亡率显著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达水平降低，促细胞凋亡蛋白Bax、酶切caspase-3蛋白表达均明显升高，上调miR-29a-3p表达后高糖诱导的MPC5细胞凋亡率明显降低，Bcl-2蛋白表达明显升高，而明Bax、酶切caspase-3蛋白表达均显降低，研究报道指出Bcl-2蛋白表达降低与Bax、酶切caspase-3蛋白表达升高可促进DN蛋白尿形成过程〔19〕。提示上调miR-29a-3p表达可通过减少足细胞凋亡进而降低蛋白尿生成。

HDAC4作为HDACs家族的一员可通过去除乙酰基促使组蛋白染色质凝集进而抑制基因转录激活，研究显示HDAC4可在基因转录调控及细胞凋亡等多种生物进程中发挥调控作用，并可促进心血管疾病、骨关节炎等多种疾病发生及发展〔20〕。HDAC4在高脂血症小鼠大脑皮质呈高表达并可促进高脂血症诱发的脑神经退行性疾病〔21〕。杨雪琛等〔22〕研究表明HDACs与糖尿病发生发展过程密切相关并可能作为治疗糖尿病的药物靶点。本研究结果说明HDAC4 表达水平升高可能促进高糖诱导足细胞损伤。采用基因干扰技术抑制HDAC4表达后MPC5细胞中synaptopodin、Bcl-2蛋白表达明显升高，而desmin、Bax、酶切caspase-3蛋白表达均显著降低，提示抑制HDAC4表达可抑制肾脏足细胞MPC5凋亡，延缓高糖诱导的足细胞损伤。Li等〔23〕研究表明HDAC4是miR-29a-3p的靶基因并可参与胃癌发生及发展进程。本研究采用荧光素酶实验发现miR-29a-3p可靶向结合HDAC4并负向调控其表达水平，为了进一步验证HDAC4在高糖诱导足细胞损伤中的作用，本研究结果提示miR-29a-3p通过抑制HDAC4表达进而抑制高糖诱导MPC5细胞凋亡并减缓足细胞损伤。

综上，高糖诱导小鼠足细胞MPC5中miR-29a-3p表达下调，HDAC4表达上调，miR-29a-3p可通过抑制HDAC4表达并减少MPC5细胞凋亡进而防止足细胞损伤最终延缓DN发生及发展，可为早期防治DN足细胞损伤提供理论依据。但关于miR-29a-3p如何调控DN足细胞损伤相关通路仍需深入研究。