醒脑静注射液对抗新冠病毒肺炎的调控机制

张 妍，王 齐，李奥强，李龙杰，魏 林，严菊芬

(1.安徽工业大学a.冶金工程学院，b.化学与化工学院，安徽马鞍山243032；2.华中师范大学化学学院，湖北武汉430079)

新冠病毒导致的新冠病毒肺炎(COVID-19)截至2020年3月17日先后在全球150多个国家和地区流行，世界卫生组织将其危害程度定义为全球大流行。中医药在改善发热、咳嗽、乏力等对症治疗方面具明显优势，我国在COVID-19治疗过程中医药参与度极高，湖北地区达75%以上，其他地区超过90%，针对中医分期分型诊治推荐不同的中药汤剂和中成药。醒脑静注射液(简称醒脑静)是被推荐用于治疗重型、危重型COVID-19 的中药注射液之一。中药的早期介入有利于控制疾病向“细胞因子风暴”发展。醒脑静由冰片、郁金、栀子和麝香4味中药提取物组成，是由中药传统名方“安宫牛黄丸”经科学提取精制而成的新型中药制剂，具醒脑开窍、清热解毒和凉血活血等功效，在肺性脑病方面有良好的治疗效果。家兔病毒性高热模型研究表明，醒脑静可减少内源性热源及脑内前列腺素E2、环磷酸腺苷的合成与释放，进而降低发热指数及持续高热时间；全身炎症反应综合症大鼠研究模型表明，醒脑静可降低血清中的NF-κB，TNF-α及IL-6水平，并对TNF-α，IL-6，IL-8等炎症因子具有抑制作用。然而现阶段醒脑静对抗COVID-19的有效活性成分及调控作用机制尚不明确。

网络药理学是系统生物学、计算生物学、多向药理学等多学科交叉融合学科，与中药从整体水平调控机体并发挥药效理念一致。该学科的出现为从整体角度系统寻找中药复方活性成分与潜在作用靶点提供了新策略，有利于发现中药多成分-多靶点之间的关系，帮助从整体角度探索中药与治疗疾病间的关联性。分子对接是研究受体与配体间相互作用，预测两者亲和力和结合模式的分子模拟方法。文中采用网络药理学和分子对接技术，通过构建醒脑静、有效成分、COVID-19相关靶点相互作用网络及蛋白质相互作用网络，分析醒脑静有效成分潜在靶点信号通路，计算醒脑静有效成分与MAPK3，3CLpro的结合亲和能，探索醒脑静对抗COVID-19的有效成分及其潜在调控机制。

1 材料与方法

1.1 醒脑静主要化学成分的筛选

利用中药系统药理学(traditional Chinese medicine systems pharmacology, TCMSP)数据库与分析平台(http://tcmspw.com/index.php)，分别以醒脑静中药材冰片、郁金、栀子为关键词进行主要化学成分检索。以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且类药性(drug like，DL)≥0.18为指标，筛选郁金和栀子的主要化学成分。按照TCMSP数据库检索规则，冰片含化学成分类药性DL值较小，对冰片不作OB和DL筛选条件的限制，将TCMSP数据库检索的冰片成分全部收录；麝香为野生动物制品，其信息未被TCMSP数据库收录，经查阅药典将麝香酮(musk ketone)作为麝香主要有效成分。

1.2 醒脑静有效成分与COVID-19潜在相关靶点基因相互作用网络的构建

从TCMSP数据库下载冰片、郁金、栀子主要化合物靶点基因，借助UniProt数据库统一靶点基因名称，利用GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)，以“musk ketone”为关键词检索麝香酮可作用靶点基因，综合以上信息得到醒脑静可作用靶点基因，利用GeneCards数据库，以“pneumonia”为关键词，检索肺炎相关靶点基因，综合ACE2共表达基因，取两者交集，得到与COVID-19相关的靶点基因。取醒脑静可作用靶点基因与COVID-19相关靶点基因交集，得到醒脑静可作用的COVID-19潜在相关靶点基因。在此基础上对步骤1.1醒脑静主要化学成分进行逆向精筛，得到与COVID-19相关靶点基因有关的醒脑静有效成分。利用Cystoscape3.7.2 软件(http:www.cytoscape.org/)构建醒脑静有效成分与COVID-19 相关靶点相互作用网络。

1.3 醒脑静潜在靶点PPI网络的构建

将上述与醒脑静相互作用的COVID-19相关靶点基因录入STRING网站(https://string-db.org/)，选择多种蛋白质，限定物种为人，选择高置信度(0.700)，隐藏网络中断开节点，得到COVID-19相关靶蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络。提取PPI网络文件，得到所有节点和连线数据，使用R语言得到核心基因，绘制PPI网络中与其他蛋白相互作用最强的前20蛋白图表。

1.4 醒脑静潜在靶点基因GO富集与KEGG通路分析

为进一步了解醒脑静潜在COVID-19 相关靶点功能及其在信号通路中的作用，将醒脑静作用的COVID-19 相关潜在靶点基因导入DAVID 数据库(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)，输入靶基因名称，限定物种为人并校正名称为office gene symbol，对其进行生物学过程基因本体(gene ontology，GO)富集分析，将所得结果导入Excel绘制成条形图进行可视化。以通路中差异表达的基因数目为标准，判断京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集程度，以显著性参数P值为限定条件，使用R语言将其绘制成气泡图进行可视化处理，同时作出部分相应KEGG通路图用于分析。

1.5 醒脑静有效成分与MAPK3，3CLpro分子的对接

使用ChemOffice 软件构建醒脑静有效成分3D 结构，采用MMFF94 力场对其进行能量最小化，保存为mol2 格式文件。在PDB 数据库(https://www.rcsb.org/)下载MAPK3 晶体结构(PDB：2ZOQ)和3CLpro 晶体结构(PDB：6LU7)。使用Sybyl分子对接软件中的Surflex-Dock模块，将醒脑静有效成分分别对接到MAPK3和3CLpro的活性空腔。对于分子对接所得构象，使用X-Score程序计算醒脑静有效成分与靶点蛋白的结合亲和能。

2 结果与分析

2.1 醒脑静主要化学成分

通过TCMSP检索到冰片、郁金、栀子化学成分共351个，其中31个来自冰片，222个来自郁金，98个来自栀子。郁金、栀子以OB≥30%且DL≥0.18进一步筛选，分别得到主要化学成分15个。按照TCMSP数据库检索规则冰片所含化学成分类药性DL值较小，综合考虑醒脑静制作时取冰片全部药材为原料的生产工艺，将TCMSP数据库检索得到的31种化合物全部作为冰片主要化学成分。麝香为野生动物制品，其信息未被TCMSP数据库收录，查阅药典将麝香酮(musk ketone)作为麝香主要化学成分。

2.2 COVID-19相关靶点基因及醒脑静有效成分

通过TCMSP数据平台筛选出冰片、郁金和栀子上述61个化学成分可能作用的相关靶点基因，分别得到冰片可作用靶点基因49个，郁金可作用靶点基因54个，栀子可作用靶点基因167个。利用GeneCards通过关键词“musk ketone”检索到麝香主要有效成分麝香酮可作用靶点基因663个。综合冰片、郁金、栀子、麝香主要化学成分可作用靶点基因，去除重复部分得到醒脑静主要化学成分可作用靶点基因761个。

利用GeneCards，通过关键词“pneumonia”检索得到肺炎相关靶点基因4 562个。相关研究表明：ACE2是新冠病毒感染人体细胞的重要受体，是病毒感染细胞必不可少的蛋白，与ACE2共表达的基因中存在与COVID-19相关的重要靶点基因。综合ACE2共表达基因(5 556个)与肺炎相关靶点基因(4 562个)，取两者交集得到与COVID-19相关的靶点基因995个。

取醒脑静主要化学成分可作用靶点基因与COVID-19 相关靶点基因的交集，得到醒脑静可作用于COVID-19的潜在相关靶点基因，172个。由醒脑静潜在作用的COVID-19相关靶点基因对上述醒脑静62个主要化学成分逆向分析，得到醒脑静与COVID-19相关的有效化学成分22种，结果如表1。

表1 醒脑静与COVID-19相关的有效成分Tab.1 Active components in Xingnaojing associated with COVID-19

续表1

2.3 醒脑静-有效成分-相关靶点相互作用网络

利用Cystoscape3.7.2软件构建醒脑静、有效成分、COVID-19相关靶点相互作用网络，结果如图1。

图1 醒脑静-有效成分-相关靶点相互作用网络Fig.1 Interaction network of Xingnaojing-active compounds-potential target

药材节点4个，化合物节点22个，COVID-19相关靶点节点172个，边236条。其中长方形代表冰片及其化合物，菱形代表郁金及其化合物，三角形代表栀子及其化合物，平行四边代表麝香及其化合物，圆形代表COVID-19相关靶点，连线表示疾病和药材、药材和成分、成分和靶点、靶点和疾病的关系。该网络中，每个化合物平均与10.73个靶点有相互作用，每个靶点平均与1.37个化合物相互作用，说明醒脑静具有整体调控、多成分作用多靶点的治疗特点。从化合物角度看，通过分析化合物-靶点的中心度值、亲中心度值以及等级值可知，在醒脑静有效成分中，与COVID-19相关靶点结合最多的前5个化合物是麝香酮(musk ketone)、槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、柚皮素(naringenin)、β-谷甾醇(β-sitosterol)，分别能和145，36，10，9，8个潜在靶点发生相互作用。5个化合物中，槲皮素、山奈酚、柚皮素属于黄酮类化合物，生物活性多样。槲皮素具抗病毒、抗炎作用，山奈酚具明显的抗炎作用，柚皮素则是一种新型免疫调节剂，麝香酮具抗痴呆、抗脑缺血、抗炎等药理作用，β-谷甾醇具抗炎、保护胃黏膜等药理活性。从靶点角度看，与醒脑静有效成分作用个数最多点的前5个靶点为PTGS1，CASP3，PPARG，BAX，ACHE，分别能与17，7，6，5，5个醒脑静有效成分有相互作用。

2.4 醒脑静潜在相关靶点的PPI网络

使用STRING网站分析醒脑静潜在相关靶点基因，得到其PPI网络，结果如图2。

图2 醒脑静相关靶点PPI网络Fig.2 PPI network of potential targets of Xingnaojing

图中节点表示靶点基因翻译蛋白，蛋白之间连线的粗细表示两者的潜在相关性，连线越粗，相关性越强。PPI图中，共涉及节点172个，连线835条，平均节点9.71个，平均局部聚类系数为0.468，PPI富集显著性参数P＜1.0×10。图3为PPI网络中与其他蛋白相互作用个数前20的蛋白，这些蛋白有与细胞因子风暴关系密切的MAPK3，CSF2，IL4，IL13，IL17A，也有与细胞凋亡有关的CASP3，BCL2L1，TNFRSF1A，FASLG，CASP8，CTLA4。

图3 PPI网络中与其他蛋白相互作用个数前20的蛋白Fig.3 Top 20 proteins interacting with other proteins in the PPI network

2.5 醒脑静相关靶点通路可视化分析

使用DAVID网站对醒脑静相关靶点进行GO富集分析，得到GO条目共计713个（P＜0.05），其中包括生物过程(biological process)613个，细胞组分(cellular component)50个，分子功能(molecular function)50个，占比分别为86%，7%，7%，各类别前20条通路如图4。

通过KEGG通路分析得到共123条通路（P＜0.05），关于病毒感染、肺炎和肺部损伤的通路包括influenza A，viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor，non-small cell lung cancer，small cell lung cancer，HIF-1 signaling pathway，toll-like receptor signaling pathway，T cell receptor signaling pathway，TNF signaling pathway，PI3K-Akt signaling pathway，MAPK signaling pathway，apoptosis 等。如图5 所示，排名前20 的通路中，有21个和16个醒脑静有效成分潜在作用靶点分别在influenza A 和TNF signaling pathway通路中发挥重要作用。醒脑静、有效成分、COVID-19相关靶点相互作用网络中具有重要调控作用的CASP3和BAX也富集在其中，PPI 网络中前20 位核心蛋白也有多个在两条通路发挥重要作用，包括MAPK3，CASP3，CASP8，CYCS，CSF2，TNFRSF1A，FASLG。

图4 醒脑静潜在作用靶点的GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of potential targets of Xingnaojing

图5 醒脑静潜在作用靶点的KEGG通路分析及其在TNF signaling pathway中的分布Fig.5 KEGG pathway analysis of potential targets of Xingnaojing and their distribution in the TNF signaling pathway

2.6 醒脑静有效成分与MAPK3，3CLpro的分子对接结果分析

为进一步探索醒脑静对抗COVID-19的核心有效成分及其调控机制，选择网络药理学预测的醒脑静潜在靶标MAPK3和新冠病毒重要蛋白3CLpro为研究对象，使用Sybyl软件中的Surflex-Dock模块将醒脑静有效成分对接到MAPK3，在3CLpro活性中心获得结合构象，计算不同构象与靶标蛋白的结合亲和能，评价对接分子与靶标蛋白的结合能力。

如表2所示，以MAPK3靶蛋白为例，以结合亲和能≤-31.0 kJ/mol为标准，醒脑静有效成分中多个化合物与MAPK3有较强的结合能力。其中：冰片中的齐墩果酸(oleanolic acid)、郁金中的β-谷甾醇(β-sitosterol)、栀子中的槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、麝香中的麝香酮(musk ketone)结合能力最强；β-谷甾醇、槲皮素、山奈酚、麝香酮也分别是醒脑静、有效成分、相关靶点相互作用网络预测作用靶点最多的前5个化合物；醒脑静中部分有效成分与3CLpro也有较好的结合能力。β-谷甾醇、槲皮素、山奈酚与MAPK3、3CLpro可能的结合方式如图6。

表2 醒脑静有效成分与MAPK3和3CLpro的结合亲和能Tab.2 Binding affinity of the active component of Xingnaojing with MAPK3 and 3CLpro

图6 β-谷甾醇、槲皮素、山奈酚与MAPK3、3CLpro可能的结合方式Fig.6 Possible combination of β-sitosterol,naringin and kaempferol with MAPK3 and 3CLpro

3 结 论

采用网络药理学和分子对接的方法对醒脑静注射液对抗COVID-19的调控机制进行研究，所得主要结论如下：

1)醒脑静对抗COVID-19存在整体调控和多成分作用多靶点的特点。从化合物角度看，醒脑静有效成分中与COVID-19相关靶点有潜在作用最多的前5个化合物分别是麝香酮、槲皮素、山奈酚、柚皮素、β-谷甾醇。分子对接的醒脑静核心有效化学成分与网络药理学预测结果基本一致。

2)醒脑静潜在靶点中相互作用最强的前20个蛋白包括与细胞因子风暴关系密切的MAPK3，CSF2，IL4，IL13，IL17A，与细胞凋亡有关的CASP3，BCL2L1，TNFRSF1A，FASLG，CASP8，CTLA4。醒脑静可作用包括Influenza A，TNF signaling pathway 等在内的多个病毒感染、肺炎和肺部损伤通路。醒脑静通过与MAPK3，CSF2，IL4，IL13，IL17A，TNF等核心靶点相互作用，参与抗炎、抗病毒、调节免疫功能等整体综合调节过程，具有干预细胞因子风暴的重要作用。

3)分子对接结果显示，醒脑静有效成分与COVID-19复制中重要蛋白3CLpro也有一定的结合能力，进一步说明醒脑静作用方式的多样性。

本研究只是通过挖掘数据预测醒脑静有效成分及其治疗COVID-19的药理作用机制，没有通过具体实验和临床验证，详细结果有待进一步通过相关实验证实。