反向高效液相色谱法同时测定千斤拔不同种、不同药用部位中醋酸乙酯部位化学成分的含量

任朝琴，戴先芝，袁玮，刘圆

（1.阿坝师范学院藏羌医药研究所，四川汶川 623000；2.西南民族大学少数民族药物研究所，四川成都 610041）

《中华人民共和国药典：一部》（2020年版）中收载千斤拔为豆科植物蔓性千斤拔Moghania philippinensis（Merr.etRolfe）Li或大叶千斤拔Moghania macrophylla（Willd.）O.Kuntze的干燥根[1]，具有镇痛、抗炎作用，可治疗妇科病[2]。地方药用的还有球穗千斤拔Moghania strobilifera（Linn.）Ait.、宽叶千斤拔MoghaniaLatifolia Benth、腺毛千斤拔Moghaniaglutiaosa（Prain）Y.T.Wei.等种。考察不同品种千斤拔的质量对千斤拔产业科学化、可持续化发展具有重要的意义。千斤拔含有黄酮、多糖、生物碱、β-谷甾醇等多种成分的测定已有报道[3]；但尚未有对千斤拔中醋酸乙酯部位化学成分燃料木素（genistein）、5，7，2’，4’-四羟基异黄酮（2’-hydroxygenistein），3，5，7，3’，5’-五羟基-4’-甲氧基黄烷（ourateacatechin）含量测定的报道。本研究拟对上述5个不同种的千斤拔不同药用部位中燃料木素、5，7，2’，4’-四羟基异黄酮、3，5，7，3’，5’-五羟基-4’-甲氧基黄烷的含量进行比较研究，以期寻找到新的药源，并进一步为临床上科学、合理和可控地使用该类药材提供一定的实验数据。现将研究结果报道如下。

1 材料

1.1 仪器Waters2695高效液相色谱（HPLC）仪（美国Waters公司）；Waters2996检测器（美国Waters公司）；Empower色谱工作站，色谱柱Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）（北京迪科马科技有限公司）；Unicam UV-500（美国Thermo electron公司）；Milli-Q超纯水系统仪，KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；METTLER AE240电子分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]。

1.2 试剂对照品：燃料木素、5，7，2’，4’-四羟基异黄酮、3，5，7，3’，5’-五羟基-4’-甲氧基黄烷，均为自制[4]，纯度分别为99.0%、98.3%、98.5%。甲醇为色谱纯（美国迪玛公司），水为超纯水及蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

1.3 药材大叶千斤拔（四川成都）、蔓性千斤拔（湖北宜昌）、球穗千斤拔（广西举城）、腺毛千斤拔（广西）、宽叶千斤拔（广西），经刘圆教授鉴定为蔓性千斤拔Moghania philippinensis（Merr.etRolfe）Li、大叶千斤拔Moghania macrophylla（Willd.）O.Kuntze、球 穗 千 斤 拔Moghania strobilifera（Linn.）Ait.、宽叶千斤拔Moghania LatifoliaBenth、腺毛千斤拔Moghania glutiaosa（Prain）Y.T.Wei.的根、茎、叶。

2 方法与结果

2.1 供试液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取“1.2”项中3种对照品，用甲醇稀释成含燃料木素1.007 52 mg·mL-1、含5，7，2’，4’-四羟基异黄酮1.005 21 mg·mL-1、含3，5，7，3’，5’-五羟基-4’-甲氧基黄烷1.006 23 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.1.2 样品溶液的制备 按照醋酸乙酯最佳提取工艺制备样品溶液：料液比为1∶14，提取温度100℃，提取时间为3 h，水浴回流提取2次。

2.2 色谱条件的选择经考察，效果最佳的色谱条件：色谱柱Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇-0.5%磷酸水（23∶77，10 min；43∶57，11～55 min）；流速：1 mL·min-1；柱温：30℃；检测波长：240 nm。HPLC色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图Figure 1 HPLC Chromatograms

2.3 线性关系的考察

2.3.1 标准曲线的制备 分别精密量取“2.1.1”项下混合对照品溶液2、4、6、8、10μL，按“2.2”项色谱条件进行测定，以进样量（μg）的对数为横坐标，峰面积值的对数为纵坐标，绘制标准曲线。

2.3.1.1 燃料木素的标准曲线 按“2.3.1”项方法，得到燃料木素的标准曲线方程为Y=1.011 6X+6.609 7，R2=0.999 6，其线性范围为2.015 04～10.075 2μg。具体结果见表1。

表1 燃料木素线性关系考察结果Table 1 Investigation result for linear relationship of genistein

2.3.1.2 5，7，2’，4’-四羟基异黄酮的标准曲线 按“2.3.1”项方法，得到5，7，2’，4’-四羟基异黄酮的标准曲线方程为Y=1.010 1X+6.486 2，R2=0.999 7，其线性范围为2.010 42～10.052 10μg。具体结果见表2。

表2 5，7，2’，4’-四羟基异黄酮线性关系考察结果Table 2 Investigation result for linear relationship of 2’-hydroxygenistein

2.3.1.3 3，5，7，3’，5’-五羟基-4’-甲氧基黄烷的标准曲线 按“2.3.1”项方法，得到3，5，7，3’，5’-五羟基-4’-甲氧基黄烷的标准曲线方程为Y=1.006 2X+5.771 9，R2=0.999 7，其线性范围为2.012 46～10.062 30μg。具体结果见表3。

表3 3，5，7，3’，5’-五羟基-4’-甲氧基黄烷线性关系考察结果Table 3 Investigation result for linear relationship of ourateacetechin

2.3.2 精密度试验 精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液5μL，连续重复进样6次。结果显示：燃料木素的相对标准偏差（RSD）为0.82%，5，7，2’，4’-四羟基异黄酮的RSD为0.75%，3，5，7，3’，5’-五羟基-4’-甲氧基黄烷的RSD为0.83%。表明精密度良好。

2.3.3 重复性试验 分别精密称取千斤拔药材6份，按照“2.1.2”项下方法制备样品溶液，按“2.2”项色谱条件进行测定，结果显示：燃料木素的RSD为0.87%，5，7，2’，4’-四羟基异黄酮的RSD为0.82%、3，5，7，3’，5’-五羟基-4’-甲氧基黄烷峰面积值的RSD为0.97%。表明重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 精密吸取同一批样品溶液10μL，按“2.2”项色谱条件于0、2、4、8、12、24 h测定，结果显示：燃料木素的RSD为0.91%，5，7，2’，4’-四羟基异黄酮的RSD为0.94%，3，5，7，3’，5’-五羟基-4’-甲氧基黄烷的RSD为1.11%。表明样品稳定性良好。

2.3.5 加样回收率试验 精密称取千斤拔药材2.5 g，共9份，分为3组分别加入混合对照品10、20、30μL，按照“2.1.2”项下方法制备样品溶液，按“2.2”项色谱条件进行测定。计算得到9份样品燃料木素平均回收率为99.75%，RSD为0.92%；5，7，2’，4’-四羟基异黄酮平均回收率为101.24%，RSD为1.13%；3，5，7，3’，5’-五羟基-4’-甲氧基黄烷平均回收率为102.35%，RSD为1.28%。

2.4 样品中3种有效成分含量的测定按照醋酸乙酯最佳提取工艺（料液比为1∶14，提取温度100℃，提取时间为3 h，水浴回流提取2次），以燃料木素、5，7，2’，4’-四羟基异黄酮、3，5，7，3’，5’-五羟基-4’-甲氧基黄烷作为含量评价指标，比较不同种千斤拔的药材质量。不同种千斤拔测定结果见表4。

表4 千斤拔样品中3种有效成分含量的测定结果Table 4 Determination result for contents of 3 effective ingredients in various samples （n=3）

3 讨论

在本课题组前期对千斤拔进行了大量系统性研究[5-9]的基础上，本研究对千斤拔的有效部位之一醋酸乙酯部位进行成分分离，得到燃料木素、5，7，2’，4’-四羟基异黄酮，3，5，7，3’，5’-五羟基-4’-甲氧基黄烷3个化合物，采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法同时测定千斤拔中燃料木素、5，7，2’，4’-四羟基异黄酮，3，5，7，3’，5’-五羟基-4’-甲氧基黄烷的含量。本研究建立了千斤拔药材中有效成分的含量测定方法，方法简便、准确，重复性好，可用于千斤拔的质量评价方法之一。

不同种千斤拔药材根部位的比较中：蔓性千斤拔根中所含的燃料木素最高，其次为腺毛千斤拔和宽叶千斤拔，大叶千斤拔含量较低，球穗千斤拔含量最低；5，7，2’，4’-四羟基异黄酮的含量，仍以蔓性千斤拔根最高，其次为宽叶千斤拔和腺毛千斤拔，大叶千斤拔含量较低，球穗千斤拔最低；3，5，7，3’，5’-五羟基-4’-甲氧基黄烷的含量，以宽叶千斤拔最高，其次为蔓性千斤拔，大叶千斤拔最低，但在球穗千斤拔和腺毛千斤拔中未检测出。

不同种千斤拔药材茎部位的比较中：蔓性千斤拔茎中所含的燃料木素最高，其次为大叶千斤拔和腺毛千斤拔，宽叶千斤拔含量较低，球穗千斤拔含量最低；5，7，2’，4’-四羟基异黄酮的含量，以蔓性千斤拔茎最高，其次为宽叶千斤拔和大叶千斤拔，腺毛千斤拔和球穗千斤拔未检出；3，5，7，3’，5’-五羟基-4’-甲氧基黄烷的含量，大叶千斤拔最高，其次为蔓性千斤拔，最低为宽叶千斤拔，但在球穗千斤拔和腺毛千斤拔中未检测出。

不同种千斤拔药材叶部位的比较中：蔓性千斤拔叶中所含的燃料木素最高，其次为腺毛千斤拔和宽叶千斤拔，大叶千斤拔和球穗千斤拔未检出；5，7，2’，4’-四羟基异黄酮的含量，以蔓性千斤拔茎最高，其次为大叶千斤拔，宽叶千斤拔、腺毛千斤拔和球穗千斤拔未检出；3，5，7，3’5’-五羟基-4’-甲氧基黄烷的含量，大叶千斤拔最高，其次为宽叶千斤拔，最低为蔓性千斤拔，球穗千斤拔和腺毛千斤拔中未检测出。

本研究测定了蔓性千斤拔、大叶千斤拔、球穗千斤拔、宽叶千斤拔、腺毛千斤拔5个样品。结果显示蔓性千斤拔的根、茎在燃料木素和5，7，2’，4’-四羟基异黄酮含量上远高于其他种，宽叶千斤拔的叶中富含3，5，7，3’，5’-五羟基-4’-甲氧基黄烷，球穗千斤拔仅根、茎中含有较少的燃料木素。从有效化学成分角度考虑，建议球穗千斤拔不宜替代药典品种蔓性千斤拔、大叶千斤拔入药；从有效化学成分资源的综合及可持续利用角度考虑，建议蔓性千斤拔的茎、叶可以与其根同等入药。

本研究所用的药材均是采摘于国内不同地区的野生药材，很难确定其准确的生长年限。对于同产地、同采收期的千斤拔药材质量有待进一步研究。

本研究仅对5种千斤拔有效成分进行含量测定来评价药材质量，尚不够全面，有待今后进一步从千斤拔中分离出更多的有效成分来全面评价药材质量。