水稻矮杆突变体的细胞学特征及基因定位研究

郝小花，向玉婷，曾 孟，杨友伟，谢 鹏，李 密，李东屏，田连福*

(1.湖南文理学院生命与环境科学学院，中国湖南常德415000；2.湖南师范大学生命科学学院作物不育资源创新与利用湖南省重点实验室，中国湖南长沙410081)

株高是水稻最重要的性状之一，理想的株高在水稻育种中占有重要地位，中等矮化有利于水稻品种耐肥、抗倒伏和高产。矮化突变体的分离和鉴定有助于阐明植物生长发育的分子机制[1]。研究表明，水稻的高度受株高主效基因的控制，同时受基因修饰、基因抑制等多种因素的影响[2]。这些基因的变化可以导致植物细胞水平的变化，如节间细胞缩短、数量减少等，其中一些与信号转导有关，另一些与相关激素的生物合成有关[3]。已报道的涉及水稻株高的基因有很多，如SD1[4]、SLR1[5]、EUI1[6]、D11[7]、BRD1[8]、D2[9]、D33[10]、D53[11]等，这些基因在赤霉素(gibberellin，GA)或油菜素内酯(brassinolide，BR)的信号转导和合成中起着非常重要的作用。

GA是调节植物生长发育不可缺少的植物激素之一，不仅在植物株高调控过程中具有重要的作用，而且在调控种子萌发、下胚轴伸长、叶片伸展及花、果实、种子发育等众多生理过程中也起着重要的作用[12]。近年来，随着拟南芥、水稻等模式植物的应用，GA在高等植物中的生物合成调控、信号转导途径等方面的研究取得突破性进展[13]。Kobayashi等[14]对水稻日本晴的营养组织和生殖组织中的内源GA进行了详细分析，一共鉴定到13种GA，不同种类的GA可能参与不同的生理过程。水稻的两个矮化品种Tan-ginbozu(dx突变体)和Waito-C(dy突变体)的地上部分均表现出GA缺陷的表型[15]，外源施加贝壳杉烯可以刺激Tanginbozu地上部分的伸长[16]。然而，尚未确定由Dx和Dy基因所控制的GA生物合成途径的具体步骤[17]。d35是一个与GA合成相关的突变体，D35基因编码GA合成初始阶段的合成酶——贝壳杉烯氧化酶(kaurene oxidase，KO)，该基因的突变使GA前体物质的产生减少，最终出现植株矮化的现象[3]。sbl(shortened basal internodes)是一个半矮杆突变体，SBL基因编码GA合成关键酶GA2ox(gibberellin 2-oxidase)，该基因的突变导致GA合成受阻，从而使植株出现矮化现象[18]。SBL主要在水稻茎秆的基部表达，所以矮化现象集中出现在水稻基部节间位置，从而使水稻获得更强的抗倒伏能力。水稻EUI(elongated uppermost internode)基因编码一个可以失活GA的P450蛋白酶，该基因突变后导致活性GA在水稻最上节间过度积累，从而引起长颈穗的植株表型[19]。

GA与其他植物生长物质之间存在相互作用，如细胞分裂素(cytokinin，CK)。Fleishon 等[20]证实在番茄花青素积累过程中，施加CK可以促进花青素的积累，施加GA则抑制花青素的积累，而同时施加GA和CK时，GA会完全抑制CK的作用。另外，在番茄下胚轴伸长过程中，外施GA可以促进下胚轴的伸长，而外施CK对下胚轴的伸长没有显著影响，当同时施加GA和CK时，则完全抑制由GA所引起的下胚轴伸长。此外，在番茄座果形成及发育过程中，生长素应答因子ARF7(auxin response factor 7)参与GA诱导的细胞膨大与生长素诱导的细胞分裂[21]。因此，GA所参与的植株形态的改变不仅是由于其含量的变化，也涉及GA与其他生长物质相互作用而进行的多重调节。

课题组前期从水稻Kitaake(Oryza sativa L.japonica)甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，EMS)诱变的M2群体中分离到一株超矮杆突变体ag1(ai-gan1)，表型分析显示突变体节间长度及其所占整株比例发生显著改变。为了对导致植株矮化的基因进行精确定位，我们利用MBS(mapping-bysequencing)方法对超矮杆突变体与野生型(wild type，WT)杂交F1代自交产生的F2后代进行全基因组序列比对分析，共筛选到6个导致蛋白质可读框发生改变的突变基因，并利用CRISPR-Cas9技术最终确定导致植株矮化的基因位于1号染色体，编码赤霉素3β-羟化酶2(gibberellin 3-betahydroxylase 2，GA3ox2)，是D18的等位基因。d18突变体的发现较早[22]，但其细胞学研究却较少。本文通过对突变体节间和剑叶的细胞学特性进行观察及对部分细胞分裂和伸长相关基因的表达水平进行检测，发现OsGA3ox2不仅抑制倒二节间细胞的伸长，而且影响剑叶和节间细胞纵向、横向的分裂能力，在水稻地上部分的形态发育中起着重要作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

水稻ag1矮杆突变体来源于本实验室构建的EMS诱变的M2突变体库，其遗传背景为粳稻品种Kitaake。经本实验室长沙和海南实验基地的多代自交和选择，突变体表型稳定。本实验使用的引物和 LB、N6D、AB、AAM、2N6-AS培养基试剂购自上海生工生物工程股份有限公司。N6D、AB、AAM、2N6-AS培养基配方参考文献[23]。RNA提取试剂Trizol、反转录酶、高保真酶、内切酶等购自Invitrogen 公司(美国)。q-RT-PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction)试剂为SYBR GreenⅠ，购自Promega公司(美国)。实验所用Cas9载体、sg-RNA载体由北京大学瞿礼嘉教授提供；农杆菌EHA105、大肠杆菌TOP10为本实验室保存。

取颗粒饱满、活性一致(同时期种植、同时收获)的野生型和突变体种子同期催芽、播种，比较野生型和突变体各个时期地上部分的差异，并记录各个时期相关性状的数据，主要包括株高、分蘖数、剑叶长、剑叶宽、千粒重、各节间长等。将ag1矮杆突变体与野生型杂交，获得F1代，F1自交后获得的F2代。材料种植成8行×8株规格的小区，行株距为20 cm×20 cm，成熟时从地面至穗顶测量株高。节间纵向细胞总数的估算方法为:节间的平均长度/细胞平均长度。

1.2 MBS全基因组测序定位

分别以野生型植株20株、自交F2后代中100株正常高度和100株矮杆植株的叶片为材料，构建3个DNA库。利用MBS_QTL全基因组测序对3个DNA库进行高通量测序，筛选候选基因。将过滤后的高质量reads与参考基因组序列数据库(http://www.ricedata.cn/gene/)进行比对，对筛选出的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点进行鉴定与分型，根据筛选出的SNP位点在3个DNA库中出现的频率统计，筛选得到符合比例的SNP位点。测序和SNP位点筛选由上海欧易生物医学科技有限公司完成。

1.3 CRISPR-Cas9基因敲除载体构建

从NCBI数据库网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)下载初步筛选的候选基因的编码序列(coding sequence，CDS)，按照 CRISPR-Cas9 系统靶序列设计的要求为每个候选基因设计两个不同的靶序列[24]，并委托上海生工生物工程股份有限公司合成靶序列(表1)。将正反向引物稀释至10 μmol/L后混合，PCR退火后再稀释成0.1 μmol/L。用BasⅠ酶切sg-RNA原始载体，体系为sg-RNA 2 μL、buffer 2 μL、BasⅠ内切酶 2 μL、ddH2O 14 μL，37 ℃酶切过夜，纯化酶切产物。用T4 DNA连接酶连接sg-RNA和PCR退火产物，体系为ddH2O 6 μL、buffer 1 μL、sg-RNA 酶切产物 1 μL、PCR 退火产物1 μL、T4连接酶1 μL，22 ℃水浴 6～8 h。用42 ℃热激法将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，随后将转化产物涂布于含卡那霉素(kanamycin，Kan)的LB平板，筛选阳性克隆并测序，将测序正确的阳性克隆扩繁，小量提取质粒并与Cas9载体进行LR重组反应，体系包含ddH2O 7 μL、阳性质粒 1 μL、Cas9 载体 1 μL、LR mix 1 μL，25 ℃水浴 1 h，随后加入 1 μL protein K，37 ℃水浴20 min终止反应。用42℃热激法将LR重组反应的产物转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，随后将转化产物涂布于含壮观霉素(spectinomycin，Spe)的LB平板，筛选阳性克隆并测序，将测序正确的阳性克隆扩繁，小量提取质粒，得到CRISPR-Cas9基因敲除载体。

表1 Os01g0177400基因CRISPR-Cas9的靶位点引物Table 1 Primers used for Os01g0177400 knockout with CRISPR-Cas9 system

1.4 农杆菌转化

电转杯预先用无水乙醇浸泡，再依次用超纯水清洗5次、无水乙醇清洗5次，最后在超净工作台内置于干净滤纸上晾干。将EHA105感受态与CRISPR-Cas9基因敲除载体置于冰上溶解3 min，同时用手套包住电转杯置于冰上。取1 μL CRISPRCas9基因敲除载体质粒(稀释100倍)混匀于EHA105感受态中，冰浴5～15 min。在无菌的EP管中加入1 mL LB液体培养基，置于37℃水浴锅中预热。将混有质粒的感受态转移至电转杯，并于电转仪上进行转化。电转后加入300 μL已预热的LB液体培养基，混匀，并将菌液完全吸出至无菌EP管中，37℃水浴1 h。吸取100 μL菌液涂布于具有Spe抗性的LB平板，30℃倒置培养30～48 h。

1.5 转基因植株的获得

将在AB培养基活化3 d的农杆菌EHA105(含转化质粒)挑取到100 mL AAM液体培养基(加入1 g/L乙酰丁香酮1.5 mL)中，180 r/min振荡培养30 min，使其OD600为0.1～0.15。将水稻成熟胚诱导7 d的愈伤组织挑入上述AAM菌液中，轻摇2～3 min，弃菌液，于超净工作台晾干；将晾干的愈伤组织转移到2N6-AS培养基中(垫一张无菌滤纸)，于25℃恒温培养箱中暗培养3 d，随后用无菌水洗涤8次，每次3 min，再用羧苄青霉素水洗涤5 min，置于无菌滤纸上晾干；将晾干的愈伤组织接种到含羧苄青霉素和潮霉素的筛选培养基上，30℃连续光照培养至新愈伤出现，将新愈伤转移到分化培养基上(筛选和分化过程中每7～10 d更换一次培养基)，待分化出芽和根即可将其移到生根瓶中培养[23]。7～10 d后，打开瓶盖，加入少量无菌水继续培养1周，然后将其转移到土壤中，使其继续生长。

1.6 石蜡切片的制作与观察

石蜡切片的制作参照文献[25]的方法进行，主要步骤如下:将材料于卡诺氏固定液固定，随后用不同浓度的乙醇进行脱水；在通风橱内依次用乙醇-二甲苯混合液与纯二甲苯进行透明，每次30 min；用二甲苯、石蜡的混合液和纯石蜡对材料进行逐步浸蜡；向折好的纸盒中倒入含有材料的纯石蜡，静置，待石蜡凝固即可进行常规切片；将切好的蜡带用载玻片进行展片；将晾干后的载玻片浸泡于纯二甲苯中，5 min，重复两次；滴加中性树胶于载玻片上，用镊子夹上盖玻片，制成永久装片。用普通光学显微镜进行切片观察。

1.7 实时荧光定量PCR

以野生型和突变体分蘖期未伸长的新叶为材料，利用Trizol试剂提取总RNA。根据RNA浓度计算反转录所需的RNA体积。cDNA第一链的合成采用Thermo Fisher Scientific公司的反转录试剂，全程配戴口罩和乳胶手套。利用Primer 5软件根据目的基因CDS序列设计引物(表2)，实时荧光定量PCR总反应体积为30 μL，试剂为SYBR GreenⅠ(Promega)，PCR 反应在 Quant Studio 5(Life Technologies公司，美国)中完成，实验重复3次[25]。

表2 实时荧光定量PCR引物Table 2 Primers used for real-time quantitative PCR analysis

1.8 数据处理

实验所得统计数据和实时荧光定量PCR数据用Excel 2003软件进行初步处理，采用 SPSS 19.0软件进行单因素方差分析。采用Origin 8.0软件制图。

2 结果与分析

2.1 突变体地上部分的形态分析

分蘖期野生型和突变体植株的表型观察结果显示，野生型和突变体的剑叶长分别为(23.81±3.51)cm、(10.72±2.42)cm，突变体剑叶长只有野生型的 45.02%(图 1A)，而剑叶宽达到(1.29±0.14)cm，是野生型(1.04±0.13)cm 的 124.04%(图 1C)；突变体的平均分蘖数为9.31个，野生型为6.82个，突变体的分蘖数显著增多(图1B，D)。此外，成熟期野生型和突变体籽粒千粒重的统计数据显示，突变体千粒重为(22.72±1.02)g，野生型为(26.21±1.36)g，突变体显著低于野生型(图1E)。以上形态分析结果表明，AG1基因的突变对水稻地上部分的生长发育有较大影响。

图1 野生型和突变体的农艺性状(A)成熟期剑叶；(B)分蘖期植株形态；(C)剑叶宽；(D)分蘖数；(E)千粒重。标尺=2 cm；数据为平均值±标准差，**表示差异极显著(P＜0.01)。Fig.1 Agronomic traits of WT and mutant plants(A)Mature flag leaves；(B)Tillering plant morphology；(C)Flag leaf width；(D)Tillering number；(E)1 000-grain weight.Bar=2 cm.Data are presented as mean ± standard deviation.Asterisks indicate significant difference from the WT plants at**P＜0.01 by Student’s t test.

此外，我们分析了不同时期突变体的株高，发现幼苗期、分蘖期和成熟期的突变体均表现出极度矮化(图2A)，其中成熟期野生型的平均株高为(52.43±5.36)cm，而突变体为(18.25±3.12)cm，仅为野生型的34.81%(图2B)。进一步统计成熟期植株的穗长以及倒一节间、倒二节间和倒三节间的长度，结果显示野生型各部分的平均长度依次为(10.91±2.32)cm、(17.13±2.12)cm、(9.91±2.36)cm和(3.64±1.27)cm，而突变体各部分的平均长度依次为(6.12±1.24)cm、(6.91±2.32)cm、(1.11±0.52)cm和(0.37±0.12)cm，均显著缩短(图 2C)。通过计算各部分长度所占整株的比例，我们发现野生型穗长以及倒一节间、倒二节间和倒三节间的长度所占整株比例分别为20.81%、32.67%、18.90%和6.94%，而突变体则为33.53%、37.86%、6.08%和2.03%，突变体穗长和倒一节间所占比例有所增加，而倒二节间和倒三节间所占整株的比例显著降低。以上数据表明AG1基因突变影响穗长及各节间的伸长，导致植株变矮及各节间变短且占整株比例发生改变。

图2 野生型和突变体的植株形态及各部分长度统计(A)幼苗期、分蘖期和成熟期的植株形态；(B)成熟期植株高度的统计；(C)穗长及各节间长度的统计。标尺=2 cm；数据为平均值±标准差，**表示差异极显著(P＜0.01)。Fig.2 Morphology of WT and mutant plants and their length statistics(A)Mutant morphology at different stages；(B)Statistics of plant height at maturity stage；(C)Statistics of internode and panicle lengths.Bar=2 cm.Data are presented as mean±standard deviation.Asterisks indicate significant difference from the WT plants at**P＜0.01 by Student’s t test.

2.2 突变体节间细胞的特征分析

为了解突变体节间长度变化的原因，我们对倒一节间和倒二节间的中部进行切片观察，并对细胞大小和数目进行测量与统计。节间纵切面的分析结果显示:突变体和野生型倒一节间细胞的平均长度分别为(109.85±12.21)μm和(126.14±11.24)μm，突变体倒一节间的细胞长度略小于野生型，约为野生型的87.09%(图3A，D)；突变体倒二节间的细胞长度为(28.32±5.31)μm(n=50)，显著小于野生型的(106.23±13.42)μm(n=50)，仅为野生型细胞长度的26.66%(图3B，E)。倒二节间纵列细胞总数目的估算结果显示，突变体纵向细胞数目显著减少，约为453个，但野生型约为1 178个。纵切面的细胞学分析结果说明，AG1突变不仅导致倒二节间细胞长度变短，而且纵向细胞数目也显著减少。节间的横切结果显示:突变体的茎秆壁厚度显著大于野生型(图3G)；突变体倒二节间横向薄壁细胞的平均层数为16层，显著多于野生型的11层(图3C，F)。这些结果表明，AG1基因的突变显著抑制倒二节间细胞的伸长和纵向分裂，促进倒二节间细胞的横向分裂，从而导致倒二节间显著缩短，茎秆壁显著增厚。

图3 野生型与突变体倒一节间和倒二节间的细胞形态(A)倒一节间纵切面细胞形态；(B)倒二节间纵切面细胞形态；(C)倒二节间横切面细胞形态；(D)倒一节间纵向细胞的长度和宽度统计；(E)倒二节间纵向细胞的长度和宽度统计；(F)倒二节间薄壁细胞层数的统计；(G)倒二节间横切面茎厚度的统计。标尺=100 μm；**表示差异极显著(P＜0.01)。Fig.3 The peduncle and penultimate internode sections of the WT and mutant plants(A)Cell morphology of the peduncle internode in longitudinal section；(B)Cell morphology of the penultimate internode in longitudinal section；(C)Cell morphology of the penultimate internode in transverse section；(D)Cell length and width statistics of the peduncle internode in longitudinal section；(E)Cell length and width statistics of the penultimate internode in longitudinal section；(F)Cell layer statistics of the penultimate internode；(G)Stem thickness statistics of the penultimate internode.Bar=100 μm.Asterisks indicate significant difference from the WT plants at**P＜0.01 by Student’s t test.

2.3 突变体剑叶细胞的特征分析

由于ag1突变体和野生型的剑叶宽度具有明显差异，因此对野生型和突变体剑叶中部的横切面进行了分析，结果显示:突变体剑叶中维管束数目显著增加，其中横切面大维管束数目平均比野生型多2.43个，小维管束数目平均增加9.52个(图4A)，但突变体中维管束周围的纵向薄壁细胞数目显著减少(图4B)。

图4 野生型和突变体的剑叶中部横切面细胞形态(A)剑叶中部横切面，黑色箭头标示两个大维管束之间的小维管束；(B)叶片中间大叶脉的放大图，红色箭头标示叶脉中的薄壁细胞。标尺=500 μm。Fig.4 Cell morphology of the transverse section at the middle part of flag leaves of the WT and mutant plants(A)The transverse section of the middle part of flag leaves.The black arrow marks the small vascular bundles between two large vascular bundles；(B)The enlarged picture of the large vascular in the middle of the leaves.The red arrow marks the parenchyma cells in veins.Bar=500 μm.

2.4 水稻AG1基因的定位与功能验证

在ag1突变体和野生型杂交获得的F1代中，全部植株的高度均正常，但在F1自交后获得的F2群体中，高、矮植株数量分别为354株和116株，符合3︰1分离比，表明该突变体矮杆性状是由单基因控制的隐性遗传。为了确定矮杆性状的控制基因，利用MBS全基因组测序对突变基因进行定位，共筛选到6个导致蛋白质可读框发生改变的SNP位点，这6个SNP位点分别分布于1号染色体的Os01g0156000基因和Os01g0177400基因、8号染色体的Os08g0352100基因和Os08g-0447100基因、9号染色体的Os09g0337300基因以及11号染色体的Os11g0200000基因(表3)。参考中国水稻网(http://www.ricedata.cn/gene/)数据，从6个基因中筛选出与下胚轴伸长功能相关的Os01g0156000基因和与GA合成功能相关的Os01g0177400基因作为候选基因进行功能验证。

利用CRISPR-Cas9系统对Os01g0156000和Os01g0177400两个候选基因分别进行基因编辑，在Os01g0156000和Os01g0177400两个基因的外显子区域分别设计两个靶序列，构建CRISPRCas9基因敲除载体，通过农杆菌介导分别得到Os01g0156000和Os01g0177400基因敲除的纯合体植株。基因敲除阳性植株的表型显示，Os01g-0156000基因敲除的阳性植株中没有出现矮秆性状的植株，而Os01g0177400基因敲除的阳性植株中存在大量的矮化植株。将Os01g0177400基因敲除的纯合阳性植株分别命名为ag1-2(图5A)、ag1-3a和 ag1-3b(图 5B)，ag1-2、ag1-3a和 ag1-3b均表现出与ag1类似的矮杆性状(图5C)，因此，确定AG1位于1号染色体的Os01g0177400基因座，该基因编码一个赤霉素3β-羟化酶，参与GA的合成代谢。

图5 Os01g0177400基因靶序列位点及阳性植株形态(A)第一个靶序列位点；(B)第二个靶序列位点；(C)基因敲除阳性植株形态。标尺=2 cm。Fig.5 Target sequence loci for the gene Os01g0177400 and morphology of positive plants(A)Firsttargetsequencelocus；(B)Secondtargetsequenceloci；(C)Themorphologyofpositiveplantsthroughgeneknockout.Bar=2cm.

2.5 突变体中与细胞分裂和伸长相关基因的表达量分析

为了了解AG1基因突变后突变体节间和剑叶细胞大小与数目变化的原因，我们进一步对野生型和突变体地上部分细胞伸长和分裂相关基因的表达量进行了实时荧光定量PCR分析。根据已知基因的功能，选取影响细胞数目的细胞周期相关基因 OsCDKB2；1[26]、CYCA3；1[27]和 CYCB2；2[26]及与细胞伸长相关的 OsE2Fl、OsMCM3[28]、OsEXPA16[29]和OsXTH28[30]基因进行表达量检测。图6结果显示，OsCDKB2；1、OsE2Fl、OsMCM3、OsEXPA16和OsXTH28基因的表达量在突变体中显著降低，说明AG1的突变对细胞分裂和伸长相关基因的表达都有一定的影响。

图6 突变体和野生型中与细胞分裂和伸长相关的部分基因的表达量变化*表示差异显著(P＜0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01)。Fig.6 Expression levels of genes related to cell division and elongation in the mutant and WT plantsAsterisks indicate significant difference from the WT plants at*P＜0.05 and**P＜0.01 by Student’s t test.

3 讨论

Os01g0177400编码赤霉素3β-羟化酶，该酶是植物体内催化产生活性GA的关键酶，在GA的合成过程中具有重要的作用。早在2001年，人们就在水稻基因组中克隆到两个赤霉素3β-羟化酶基因OsGA3ox1和OsGA3ox2[31]，研究表明这两个基因具有完全不同的表达模式，分别主要在植物的营养器官和生殖器官中表达。这两个基因的表达方式可能与植物营养器官和生殖器官中发现的优势生物活性GA的差异有关[14，32]，其通过调控营养器官和生殖器官中不同形式的活性GA从而调控植株不同部位的生长和发育。

表3 MBS_QTL全基因组筛选的SNP位点Table 3 SNP loci screened from MBS_QTL

在前期研究中，我们将野生型粳稻品种Kitaake用EMS进行诱变，在诱变的M2代群体中发现了超矮杆突变体ag1(图1A)。将突变体ag1与野生型杂交，获得的F1代群体全部表现为高杆，而F1自交后代F2群体中高杆和矮杆的数量比为3︰1，说明此矮杆性状为单基因控制性状。通过MBS_QTL技术筛选到6个候选的突变基因，进一步通过CRISPR-Cas9技术对6个候选基因进行基因敲除验证，发现只有Os01g0177400基因敲除的后代中出现矮杆性状的植株(图5C)，由此确定突变基因为Os01g0177400。本研究的统计分析发现，突变体成熟期的高度只有野生型的34.81%，突变体倒二节间和倒三节间的长度仅占整株高度的6.08%和2.03%，所占整株比例显著低于野生型，是突变体株高变矮的主要原因(图2C)。同时，突变体剑叶变宽，分蘖数也显著增加。通过对倒一节间、倒二节间和剑叶的中部进行切片分析发现，突变体倒一节间细胞的长度有所变短，但较野生型没有显著差异；而倒二节间细胞的长度较野生型显著变短；倒二节间纵向细胞总数目和剑叶中大维管束周围的纵向薄壁细胞数目都显著减少，从而导致突变体倒二节间长度显著缩短、剑叶大维管束变小。同时，突变体剑叶中小叶脉的数目和倒二节间横向薄壁细胞层数较野生型都显著增多，从而导致突变体剑叶变宽、倒二节间的茎壁厚度增加(图3～4)。细胞形态的观察结果说明，AG1基因突变不仅影响了倒二节间细胞的伸长，而且对倒二节间和剑叶细胞的纵向和横向分裂能力也具有一定影响。

已有研究表明，GA与其他的生长物质之间存在相互作用并共同调控植株的发育，如与CK的拮抗作用等。因此，水稻ag1突变体倒二节间和剑叶的细胞数目及形态的变化可能与OsGA3ox2的表达模式有关，OsGA3ox2的突变导致不同部位的活性GA含量发生改变，从而影响相互作用的其他生长物质发生变化，进而导致细胞的形态和分裂能力都发生变化。在本研究的超矮杆突变体ag1中，与细胞分裂相关的基因OsCDKB2；1、OsE2Fl、OsMCM3以及与细胞伸长相关的基因OsEXPA16和OsXTH28的表达量都较野生型发生了明显的变化，说明AG1基因在影响GA合成的同时，还可能与其他生长物质交叉互作从而严重影响植株的形态变化，因此，研究GA与其他生长物质的交叉互作，将为阐明植物形态发育提供重要的线索。