铁皮石斛益消方对肝胃不和型功能性消化不良模型大鼠的作用研究

许银银 蒋泽天 熊桃秀 雷珊珊 李波 陆婷婷 俞巧仙 吕圭源 陈素红*

功能性消化不良（functional dyspepsia，FD）是临床上较常见的一种消化系统疾病，具有包括餐后饱胀不适、早饱感、上腹痛、上腹烧灼感等症状，经各项检查排除相关器质性病变的疾病［1］。研究显示，当前全球FD 的患病率为10%～30%［2］，本病一般病程较长，影响患者生活，且容易反复发作，难以彻底治愈［3］。中医药治疗功能性消化不良在缓解症状、减少复发等方面具有其特色和优势［4］。铁皮石斛为兰科植物铁皮石斛的干燥茎，药用历史悠久。《神农本草经》曰：“久服厚肠胃，轻身延年”。铁皮石斛“厚肠胃”的疗效可使胃肠生理强壮，胃肠功能增强，表现为维护胃肠健康和促进功能改善［5-10］。铁皮石斛益消方在铁皮石斛“厚肠胃”的药效基础上配伍“疏肝解郁”中药加减组方，有利于铁皮石斛防治FD 等胃肠道疾病的药物研究与开发，以期开发防治肝胃不和型FD 的方药。FD 被认为是生物因素和社会心理因素共同作用的体现，胃肠动力障碍与精神情志障碍是导致FD 发病的重要因素，脑肠轴功能的异常是发病的核心机制［11］。本实验模拟人“情志不畅”加“饮食不节”的不良生活方式，采用夹尾刺激复合饥饱失常法制备肝胃不和型FD 大鼠模型，通过观察铁皮石斛益消方对FD 大鼠的胃肠功能以及相关脑肠肽指标评价综合药效，同时为探索其可能的作用机制提供基础。

1 实验材料

1.1 实验动物 72 只SPF 级SD 大鼠，雌雄各半，体质量（200±20）g，浙江省医学科学院提供，动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0002。饲养环境：保持饲养房通风良好，灯光照明12 h/d，温度22～25 ℃，湿度60%～70%。

1.2 药物与试剂 铁皮石斛（批号20180610）购自浙江森宇有限公司，香附（批号1906035）购自浙江英特医药股份有限公司，枸橼酸莫沙必利分散片（批号190425）购于成都康弘药业集团股份有限公司，大鼠胃动素（MTL）（批号201912）、大鼠血管活性肽（VIP）（批号201912）、大鼠5-羟色胺（5-HT）（批号201912）ELISA 试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司，胃蛋白酶试剂盒（批号20191217）购于南京建成生物生物工程研究所；H&E 染色液（批号J22D9Y78310）购于上海源叶生物科技有限公司。受试药的制备：铁皮石斛益消方（铁皮石斛、香附等药材煎煮浓缩而成）由浙江中医药大学药物研究所制备，取复方加蒸馏水浸泡煎煮，取滤液，在旋转蒸发仪中浓缩至生药浓度为1.16、0.58、0.29 g/ml，置4 ℃冰箱备用。阳性药的配制：枸橼酸莫沙必利分散片（规格5 mg/片），与蒸馏水配比成浓度0.15 mg/ml 的混悬液，置4 ℃冰箱备用。半固体营养糊的制备［12］：将10 g 羧甲基纤维素钠溶于250 ml蒸馏水中，依次加入16 g 奶粉、8 g 白糖、8 g 淀粉和2ml 黑色墨汁，充分搅拌均匀，制备约300 ml 左右的黑色半固体糊，置4 ℃冰箱备用。

1.3 仪器 EPOCH2C 酶标仪（美国Bio Tek），VIP5JR脱水机（日本SAKURA），RM2245 切片机（德国LEICA公司），JPWS-10T 超纯水仪（杭州永洁达净化科技有限公司），旋转蒸发仪（上海申盛生物科技有限公司），MiCRoc117 离心机（德国Thermo），BAS124S 电子分析天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司），HWS-26 型电热恒温水浴锅（常州诺基有限公司），P10/P200/P1000移液枪（德国Eppendorf）。

1.4 造模与给药方法 72 只SPF 级健康SD 大鼠，雌雄各半，适应性喂养3 d，称重，随机分成正常组，模型组，莫沙必利组，铁皮石斛益消方高、中、低剂量组（11.66、5.83、2.92 g/kg），每组12 只。采用饥饱失常复合夹尾刺激法造模：每天晚上9 点到第2 天早上9 点禁食，饮水自由；夹尾法刺激大鼠，用纱布包裹止血钳轻度钳夹鼠尾后1/3 处，立即放开，30 min/次，2 次/d。正常组大鼠不予任何干预。造模2 周后各给药组每天上午分别给予阳性药或受试药（10 ml/kg）1 次/d，正常组和模型组灌胃等量饮用水，边造模边给药，连续2 周。

1.5 观察指标 （1）体质量、进食量、背温的测定：给药期间，每天下午14 ∶00 对大鼠进行称重记录。每日上午9 ∶00 每笼大鼠给予100 g 普通固体饲料，至晚上9 ∶00，记录每笼大鼠的日进食量，并计算平均每只大鼠的日进食量。用红外温度显示仪测背温并拍照，用FIRE 软件处理图像。（2）血清D-木糖的测定：给药2 周后，每只大鼠禁食、不禁水18 h 后，按照10 ml/kg 的灌胃剂量灌胃3%的D-木糖，1 h 后眼眶取血备用。根据间苯三酚法检测血清D-木糖的浓度。（3）胃残留率和小肠推进率的测定：末次给药后，禁食18 h（自由饮水），大鼠灌胃给予半固体营养糊1 ml/100 g。20 min 后腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉开腹，剪取完整的胃，将胃内容物取下，剔除胃表面黏膜，擦净表面粘液、血液，称量全胃重量，然后沿胃弯处剪开胃体，以生理盐水洗去胃内固体糊，拭干后拍照并称量胃净重。胃残留率（%）=胃残留物重（g）/灌胃的营养糊重（g）×100%。剪取肠管幽门至回盲部，用卷尺测量肠管的长度，即小肠总长度；测量幽门至碳墨前沿的距离，即碳墨在小肠内推进的距离。小肠推进率（%）=碳墨推进长度（cm）/小肠总长度（cm）×100%。（4）血清指标检测：大鼠麻醉后腹主动脉采血，3500 r/min离心10 min，分离上层血清备用。采用ELISA 法检测大鼠血清中MTL、VIP、5-HT 的含量。（5）胃蛋白酶活力检测：取大鼠胃组织，按比例加入匀浆介质，组织匀浆机碾磨，取上清液，严格按照胃蛋白酶测试盒说明书操作。（6）胃组织病理学观察：取大鼠胃组织置于4%中性福尔马林固定，经脱水后，包埋切片，进行HE 染色，光镜下观察组织病理学改变。

1.6 统计学方法 采用SPSS 19.0 统计学软件。计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 模型大鼠一般体征、体质量及进食量情况 正常组大鼠毛色光泽，精神状态良好，活动自如，排便正常。模型组大鼠毛色灰暗，稀疏易脱，精神萎靡，易怒，喜打斗，或扎堆聚集，排便量减少，粪便质地改变，偶见不成形，也有质地干硬。经药物干预后，给药组大鼠精神状态有所改善，行动敏捷，大便成形。

2.2 铁皮石斛益消方对FD 大鼠体重的影响 见表1。

表1 铁皮石斛益消方对FD大鼠体重的影响［n=12，（±s）］

表1 铁皮石斛益消方对FD大鼠体重的影响［n=12，（±s）］

注：与正常组比较，*P＜0.05，#P＜0.01

组别 给药剂量 造模2 周（g） 给药2 周（g） 体重增长率（%）正常组 - 283.08±36.21 373.95±50.38 32.10模型组 - 252.99±25.43* 300.20±33.90# 18.66莫沙必利组 1.56 mg/kg 253.43±23.81* 335.83±45.45 32.51铁皮石斛益消方高剂量组 11.66 g/kg 252.76±23.78* 333.44±39.46 31.92铁皮石斛益消方中剂量组 5.83 g/kg 252.82±25.47* 336.53±44.06 33.11铁皮石斛益消方低剂量组 2.92 g/kg 253.05±23.79* 330.77±41.48 30.71

2.3 铁皮石斛益消方对FD 大鼠摄食量的影响 见表2。

表2 铁皮石斛益消方对FD大鼠摄食量的影响［n=12，（±s）］

表2 铁皮石斛益消方对FD大鼠摄食量的影响［n=12，（±s）］

注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，▲P＜0.01

组别 剂量 摄食量（g）给药1 周 给药2 周正常组 - 24.47±3.40 19.60±1.61模型组 - 15.04±2.20* 15.58±0.19*莫沙必利组 1.56 mg/kg 20.06±0.80 ▲ 19.59±4.29铁皮石斛益消方高剂量组 11.66 g/kg 18.83±0.89# 19.11±2.00#铁皮石斛益消方中剂量组 5.83 g/kg 22.79±0.82 ▲ 19.23±1.99#铁皮石斛益消方低剂量组 2.92 g/kg 19.57±1.73# 20.91±3.59#

2.4 对模型大鼠背温的影响 见表3 和图1。

表3 铁皮石斛益消方对大鼠背温的影响［n=12，（±s）］

表3 铁皮石斛益消方对大鼠背温的影响［n=12，（±s）］

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

组别 剂量 背温（℃）正常组 - 29.45±1.94模型组 - 31.14±0.40*莫沙必利组 1.56 mg/kg 30.77±0.60铁皮石斛益消方高剂量组 11.66 g/kg 30.64±1.36铁皮石斛益消方中剂量组 5.83 g/kg 30.34±0.88#铁皮石斛益消方低剂量组 2.92 g/kg 30.46±0.67#

图1 铁皮石斛益消方对大鼠背温的影响。注：A． 正常组；B． 模型组；C． 莫沙必利组；D． 铁皮石斛益消方高剂量组；E． 铁皮石斛益消方中剂量组；F． 铁皮石斛益消方低剂量组

2.5 对模型大鼠血清D-木糖含量的影响 见表4。

表4 铁皮石斛益消方对大鼠血清D-木糖的影响［n=12，（±s）］

表4 铁皮石斛益消方对大鼠血清D-木糖的影响［n=12，（±s）］

注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05

组别 剂量 血清D-木糖（μmol/L）正常组 - 0.22±0.04模型组 - 0.16±0.04*莫沙必利组 1.56 mg/kg 0.18±0.06铁皮石斛益消方高剂量组 11.66 g/kg 0.20±0.05#铁皮石斛益消方中剂量组 5.83 g/kg 0.19±0.03#铁皮石斛益消方低剂量组 2.92 g/kg 0.17±0.03

2.6 对模型大鼠胃内残留率及小肠推进率的影响 见图2。

图2 铁皮石斛益消方对模型大鼠胃内残留率（A）及小肠推进率（B）的影响。注：与正常组比较，★P＜0．05；与模型组比较，#P＜0．05，##P＜0．01

2.7 对模型大鼠胃黏膜组织病理学的影响 胃黏膜大体观结果显示，各组大鼠胃黏膜成浅红色，皱襞正常，无明显溃疡、糜烂和出血点（见图3），各组大鼠胃黏膜无明显形态学改变。进一步的HE 染色结果显示，正常组和各给药组大鼠胃黏膜上皮细胞完整，下层可见少量中性粒细胞浸润，细胞排列整齐，腺体排列比较整齐；模型组可少见腺体缺失，可见充血的毛细血管，部分上皮细胞脱落，无明显病理形态学改变（见图4）。

图3 铁皮石斛益消方对胃黏膜大体观的影响。注：A． 正常组；B． 模型组；C． 莫沙必利组；D． 铁皮石斛益消方高剂量组；E． 铁皮石斛益消方中剂量组；F． 铁皮石斛益消方低剂量组

图4 铁皮石斛益消方对大鼠胃黏膜病理形态影响（HE，×200）。注：A．正常组；B． 模型组；C． 莫沙必利组；D． 铁皮石斛益消高剂量组；E． 铁皮石斛益消中剂量组；F． 铁皮石斛益消方低剂量组

2.8 对模型大鼠胃蛋白酶活力的影响 见表5。

表5 铁皮石斛益消方对大鼠胃蛋白酶活力的影响［n=8，（±s）］

表5 铁皮石斛益消方对大鼠胃蛋白酶活力的影响［n=8，（±s）］

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

组别 剂量 胃蛋白酶活力（u/mgprot）正常组 24.18±2.77模型组 20.88±2.19*莫沙必利组 1.56 mg/kg 23.39±2.07#铁皮石斛益消方高剂量组 11.66 g/kg 23.05±2.77铁皮石斛益消方中剂量组 5.83 g/kg 23.95±3.97铁皮石斛益消方低剂量组 2.92 g/kg 21.92±2.81

2.9 对模型大鼠血清MTL、VIP、5-HT 含量的影响 见图5。

图5 铁皮石斛益消方对大鼠血清MTL（A）、VIP（B）及5-HT（C）的影响。注：与正常组比较，★P＜0．05，★★P＜0．01；与模型组比较，#P＜0．05，##P＜0．01

3 讨论

功能性消化不良在中医学属于“痞满”、“胃脘痛”范畴［13］。中华中医药学会脾胃病分会在2017 年的《消化不良中医诊疗共识意见》中，根据中医辨证将FD 分为脾虚气滞证、肝胃不和证、脾胃湿热证、脾胃虚寒（弱）症和寒热错杂证五类。其中肝胃不和证是临床上最为常见的类型之一，本证大多为情志不舒，肝郁气滞而影响胃肠功能，或饮食损伤胃气，胃病及肝所致。多以理气解郁，和胃降逆法治之。铁皮石斛益消方中以铁皮石斛清火养胃生津；香附，疏肝解郁，理气宽中，两者共为君药。综合全方，散收并用，疏养结合，肝脾胃同治，气血兼顾，共奏疏肝理气，调脾和胃之功。

本实验采用了夹尾刺激模拟人的“情志不畅”、“怒伤肝，久则郁”，制作大鼠肝郁模型；复合不规则喂养法，模拟人的“饮食不节”、“饥饱失常，肠胃乃伤”，造成大鼠胃肠动力障碍。两种复合因素造模，更符合FD临床发病情况。本实验发现模型大鼠毛发凌乱，精神萎靡，易怒或蜷缩在角落，自主活动能力减少，同时体重和摄食量显著下降，胃肠动力显著下降，小肠吸收能力下降，成功制备出符合肝胃不和型的FD 大鼠模型。

铁皮石斛益消方的药效实验结果显示，大鼠给予铁皮石斛益消方后，体重和摄食量均有一定程度的恢复，还可改善肝郁内热所导致的背温升高。由于D-木糖在小肠吸收后，不被肝脏代谢，直接被小肠黏膜吸收进入血液，所以血清D-木糖常被用来评价小肠的吸收功能。实验发现模型组大鼠血清D-木糖含量显著降低，小肠吸收能力减弱。给药铁皮石斛益消方后，大鼠血清D-木糖含量有所提高，提示铁皮石斛益消方可以提高小肠的吸收能力。胃内残留率和小肠推进率是研究胃肠功能的基本实验方法，为评价FD 严重程度的两个最主要指标。与正常组相比，模型组胃内残留量显著升高，小肠推进率显著下降，铁皮石斛益消方给药后增强了模型大鼠的胃排空能力和小肠推动能力，初步证实了铁皮石斛益消方治疗FD 的效果。

双向脑-肠相互作用在FD 患者中起着重要作用，脑-肠肽如MTL、VIP 等来源于胃肠道的物质被输送至血液循环中，下丘脑通过来自中枢神经系统的激素信号和外周神经信息调节生理功能。本实验也进一步研究了铁皮石斛益消方治疗对FD 相关的脑肠肽（MTL、VIP、5-HT）水平的影响。MTL 和VIP 作为胃肠动力相关的脑肠肽在调节胃肠运动中发挥着重要作用。MTL 是由上小肠分泌的含有22 个氨基酸的肽，可通过增强迁移运动复合物通过内分泌和神经途径刺激胃肠运动收缩。VIP 是一种28 个氨基酸的神经肽，该神经肽参与许多生理肠道功能，在胃肠道中抑制胃肠运动及胃排空、减慢小肠运动等作用。临床发现FD 患者的胃排空障碍、收缩力减弱、小肠运动减弱与血浆MTL 水平的降低［14］、VIP 水平的升高有关［15］。在给药组中，造模导致血清MTL 和VIP 水平显著改善。因此，模型组中大鼠血清MTL 的减少和VIP 的升高可能是FD 胃肠动力减弱症状的原因之一，铁皮石斛益消方通过提高其水平促进了胃肠动力功能。

5-HT 是一种具有多重生物学效应的脑肠肽，具有促进胃肠道运动、刺激胃肠激素分泌等作用，并参与调节情感、认知、情绪等生理活动的调节。同时5-HT的表达降低也是抑郁症发病的重要生物学基础之一。本实验研究发现，模型组大鼠血清的5-HT 含量降低，这与大鼠的肝郁，情志不畅的状态相符；铁皮石斛益消方可使模型大鼠的5-HT 含量恢复至正常水平，使大鼠的精神状态得到改善。提示铁皮石斛益消方改善FD 模型大鼠的作用机制与神经递质的释放有关，表现为血清5-HT 含量的增加，改善了模型大鼠精神状态，自主活动和探索能力增加，从而促进胃肠道运动。铁皮石斛益消方可以通过调节这些脑肠肽的水平，进而改善FD 大鼠的胃肠道功能。

综上所述，铁皮石斛益消方改善肝胃不和型FD 大鼠的作用机制与双向调节胃肠激素有关，表现为增加模型大鼠血清MTL 含量，下调血清VIP 水平，并通过促进神经递质5-HT 的释放，促进模型大鼠的胃排空及小肠推进，增加小肠的吸收能力，最终改善胃肠道动力障碍。