胶体金免疫层析法与酶抑制率法快速检测果蔬中农药残留比较研究

邓家军 杨琳芬 张富生 王兆芹 廖健 魏敏芝 叶琴 王茜 张志芳 陈玲

摘要 运用胶体金免疫层析法与酶抑制率法快速检测蔬菜、水果中高风险农药残留，以腈菌唑、三唑磷、水胺硫磷、氟虫腈、百菌清5种农药为例。结果显示，胶体金免疫层析法重复性好，有较高的特异性和灵敏度，检出限可满足GB 2763—2019中规定的最大残留限量要求，无假阳性、假阴性现象，相对准确度较高。与现行有效的国家标准GB/T 5009.199—2003中酶抑制率法相比，胶体金试纸条具有操作简便、检测速度快、受检测环境温度影响较小等特点，适用于对蔬菜、水果中农药残留的现场筛查和检测。

关键词 胶体金免疫层析法;酶抑制率法;快速检测;果蔬;农药残留

中图分类号 TS207.5+3  文獻标识码 A  文章编号 0517-6611（2021）04-0191-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.04.052

Study on Comparation of Colloidal Gold Immunochromatography Assay and Enzyme Inhibition Method on the Rapid Detection of Pesticide Residues in Vegetables and Fruits

DENG Jia-jun1，2， YANG Lin-fen1，2， ZHANG Fu-sheng1，2 et al

（1. Testing Center of Agro-product Quality and Safety of Jiangxi Province， Nanchang，Jiangxi 330046;2. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-products of Ministry of Agriculture and Rural Affairs（Nanchang）， Nanchang，Jiangxi 330046）

Abstract Colloidal gold immunochromatography assay and enzyme inhibition methods were used to rapidly detect high risk pesticide residues in vegetables and fruits. Five pesticides including myclobutanil， triazophos， isocarbophos， fipronil and chlorothalonil were taken as examples.The results showed that the colloidal gold immunochromatography assay had better repeatability， higher specificity and higher sensitivity， and the detection limit could meet the maximum residue limit specified in GB 2763 - 2019. Furthermore， neither false-positive and false-negative test results were obtained using this assay， also relative accuracy was higher. Compared with enzyme inhibition method according to the current national standard GB/T 5009.199 - 2003，the colloidal gold immunochromatography assay had the characteristics of simple operation， fast detection， and was less affected by ambient temperature， and was suitable for on-site screening and detection of pesticide residues in vegetables and fruits.

Key words Colloidal gold immunochromatography assay;Enzyme inhibition method;Rapid detection;Vegetables and fruits;Pesticide residues

基金项目 江西省蔬菜质量安全风险评估项目（30204003）。

作者简介 邓家军（1974—），男，江西南昌人，农艺师，博士，从事农产品质量安全风险评价、污染生态修复等方面的研究。

通信作者，推广研究员，从事农产品质量安全方面的研究。

收稿日期 2020-08-27

农产品质量安全事关人民群众身体健康和生命安全，事关政府形象和社会稳定，事关农民增收和经济持续稳定发展[1-2]。由农药残留引起的食品安全问题越来越受到关注[3-7]。《中共中央国务院关于深化改革加强食品安全工作的意见》（中发〔2019〕17号）及国务院食品安全委员会贯彻落实《中共中央 国务院关于深化改革加强食品安全工作的意见》有关政策措施的分工方案中明确指出，到2020年，农产品和食品抽检量达到4批次/千人。农业农村部决定在全国试行食用农产品合格证制度，也势必会让食用农产品生产经营者销售食用农产品时进行自检。目前食用农产品中农药残留分析检测技术常采用气相色谱、液相色谱、色谱质谱联用等仪器设备，按照GB 23200.8、GB 23200.34、GB 23200.113、GB/T 5009.20、GB/T 5009.105、GB/T 20769、NY/T 761、NY/T 1379、NY/T 1455、SN/T 1982、SN/T 2320等标准进行检测。这些方法虽然灵敏度和准确度较高，但样品前处理复杂，需要昂贵的仪器设备及专业技术人员，不能满足农产品尤其是生鲜农产品在政府监管、生产经营者自查等方面的庞大需求[8-10]，亟需一种易操作、快速和低成本的农药残留检测技术。

农药残留快速检测技术主要包括生物传感器（酶传感器、免疫传感器、适配体传感器、细胞传感器）、光谱技术（近红外光谱、太赫兹时域光谱、拉曼光谱等）与微流控技术[11]，各种快速检测技术水平及产品性能参差不齐。现行有效地广泛应用于我国果蔬中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的酶抑制率法快速检测技术（GB/T 5009.199—2003）[12]，只能进行大类（有机磷和氨基甲酸酯类）检测，且该方法的检出限不能满足《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量GB 2763—2019》[13]中规定的果蔬中农药最大残留限量要求。该研究拟应用酶抑制率快速检测技术与胶体金免疫层析快速检测技术，检测果蔬（以圆白菜、苹果为例）中5种高风险农药（腈菌唑、三唑磷、水胺硫磷、氟虫腈、百菌清）残留（依据农业农村部及省级例行监测和风险评估等结果），从而筛选出灵敏度、特异性及相对准确度等较高的农药残留快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 试材 圆白菜、苹果（南昌市超市）。腈菌唑、三唑磷、水胺硫磷、氟虫腈、百菌清5种农药标准溶液（广州化学试剂厂）。

1.2 仪器设备和产品

2000SBL 电子天平（美国 Setra 公司）;722型分光光度计（上海高致精密仪器有限公司）;恒温水浴箱（常州金坛恒丰仪器制造有限公司）。手持式食品安全分析仪及腈菌唑、三唑磷、水胺硫磷、氟虫腈、百菌清5种农药胶体金快速检测试纸条（北京勤邦生物技术有限公司）;4种常见的酶抑制率法快速检测试剂盒（产品1、产品2、产品3、产品4，市场购买）。

1.3 检测方法

1.3.1 酶抑制率法。

1.3.1.1 检测原理。

有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶的抑制率与农药浓度呈正相关。正常情况下，乙酰胆碱水解产物与显示剂反应，产生黄色物质，用分光光度计在412 nm 处测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率，根据抑制率可以判断出样品中有机磷或氨基甲酸酯类农药是否超标。

1.3.1.2 检测步骤。

运用酶抑制率法快速检测试剂盒产品1、产品2、产品3、产品4对加标有机蔬果样品进行快速检测，具体操作步骤按GB/T5009.199—2003[12] 中的酶抑制率法进行如下：

（1）样品处理。

选取有机圆白菜（苹果）（不使用农药）样品500 g，擦去表面泥土，剪成1 cm左右碎片。取样品1 g，放入提取瓶中，按照表1所示的浓度梯度在样品提取瓶中添加农药三唑磷、水胺硫磷的标准溶液（酶抑制率法只能检测有机磷和氨基甲酸酯），加入5 mL缓冲液，振荡1～2 min，倒出提取液，静置3～5 min，待用。每個梯度设3个平行。

（2）对照溶液测试。

先于试管中加入2.5 mL缓冲液，再加入0.1 mL酶液、0.1 mL显色剂。摇匀后于37 ℃放置15 min以上（每批样品的控制时间应一致）。加入0.1 mL底物摇匀，检液开始显色反应时，立即放入仪器比色池中，记录反应3 min的吸光度的变化值ΔA0。

（3）样品溶液测定。

先于试管中加入2.5 mL样品提取液，其他操作与对照测定相同，记录反应3 min的吸光度的变化值ΔAt。

（4）结果计算。

抑制率=[（ΔA0-ΔAt）/ΔA0]×100%，

式中，ΔA0为对照液反应3 min的吸光度的变化值;ΔAt为样品溶液反应3 min的吸光度的变化值。

（5）试验结果判断。

当果蔬样品提取液对酶的抑制率大于50% 时，表示样品中有高剂量的有机磷或氨基甲酸酯类农药残留，可判定样品为阳性结果。

1.3.2 胶体金免疫层析法。

1.3.2.1 检测原理。

在胶体金竞争法免疫层析中可以根据胶体金标记对象的不同分成抗体金标型和抗原金标型。样品液滴加到样品垫上后，受毛细作用力向金标垫层析，随后胶体金标记物复溶于溶液中并随溶液一起向T线移动。若样品液中没有被分析物，则胶体金标记物与T 线上蛋白特异性结合形成线条，即阴性。若样品中有被分析物，在抗体金标型中，小分子物质与T 线上的抗原竞争结合胶体金上的抗体;在抗原金标中，小分子物质与胶体金上的抗原竞争结合T 线上的抗体，2种情况都使得金标记物不能与T 线上物质结合，从而不能产生线条，即阳性。试纸条由PVC 底板、样品垫、金标垫、NC 膜和吸水垫组成（图1）。

1.3.2.2 检测步骤。

选取有机圆白菜或苹果（不使用农药）样品500 g，将样品擦去泥土（不可水洗），剪碎成小于1 cm见方的碎片或细碎小丁，装入洁净容器内，密封并标识。称取制备好的试样于离心管中，按表2所示浓度梯度添加5种农药（腈菌唑、三唑磷、水胺硫磷、氟虫腈、百菌清）的标准溶液。加入适量0.02 mol/L磷酸缓冲液，手动振荡30 s，静置1 min，上清液供测定用（称样量和加入提取液的量根据检测药物不同会有所差异）。每个梯度设3个平行进行试验。所有操作应在室温（20～25 ℃）进行，残留检测试纸条应回升至室温（20～25 ℃）后方可使用。取残留检测试纸条（即开即用）置于平整的台面上，向样品垫中加入100 μL待测样品液，液体流动后10 min观察结果。同时进行平行试验、空白试验、质控试验。

阳性：C线显色，T线不显色或T线显色比C线显色浅（图2）;阴性：C线显色，T线显色与C线显色相当或比C线显色深（图3）;无效：C线不显色（图4）。如果观察结果不能确定被检测样品是阳性还是阴性时，可以把胶体金快速检测试纸条放进手持式食品安全分析仪中进行确认。

1.3.3 重复性。

测试基质为圆白菜、苹果，采用空白样本、三唑磷、水胺硫磷添加浓度为 3 mg/kg 的加标阳性样本进行验证，分别用产品1、产品2、产品3、产品4及胶体金试纸条进行检测，每一水平3平行，计算 POD 值（检出阳性结果次数占所有检测结果的比率）。

1.3.4 快速检测方法评价指标的计算。

根据《食品快速检测方法评价技术规范》[14]计算灵敏度、特异性、假阴性、假阳性及相对准确度等指标。

2 结果与分析

国家卫生健康委员会、农业农村部和国家市场监督管理总局联合发布了《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2019）[13]，GB 2763—2019规定了腈菌唑、三唑磷、水胺硫磷、氟虫腈、百菌清5种农药在不同蔬菜、水果样本中的残留限量要求（表3）。由此可判断酶抑制率法与胶体金免疫层析法检测果蔬中农药残留的检出限差异。

2.1 酶抑制率法检测果蔬中农药残留

选择在市场上应用较为广泛的4种基于酶抑制率法的快速检测产品（产品1、产品2、产品3、产品4），用于检测圆白菜、苹果中三唑磷、水胺硫磷2种有机磷农药残留，产品1、产品2、产品3、产品4只能检测5种农药中的三唑磷、水胺硫磷（表4～5）。

由表4可知，在圆白菜样品中添加浓度0～5 mg/kg的三唑磷，产品3检出限最低，为2 mg/kg，其次是产品1、产品2，均为3 mg/kg，检出限最高的是产品4，高于5 mg/kg;在检测27个圆白菜样品中，灵敏度最高的是产品3，为91.7%，其次是产品1、产品2，分别为55.6%、22.2%，产品4在三唑磷添加浓度范围内没有检测出阳性样品，灵敏度最低;除了产品4没有特异性之外，其他3种快速检测产品都有100%的特异性;假阴性率最低的是产品3，为8.3%，其次是产品1、产品2，分别为44.4%、77.8%，产品1、产品2、产品3假阳性率均为0，产品4在三唑磷添加浓度范围内没有检测出假阳性及假阴性样品;相对准确度最高的为产品3，为96.3%，其次是产品1、产品2，分别为85.2%、74.1%，产品4在三唑磷添加浓度范围内没有检测出阳性样品，相对准确度最低。

在苹果样品中添加浓度为0～5 mg/kg的三唑磷，产品3检出限最低，为1 mg/kg，其次是产品1，为2 mg/kg，产品2和产品4的检出限均高于5 mg/kg;在检测27个苹果样品中，灵敏度最高的是产品3，为100%，其次是产品1，为91.7%，产品2和产品4在三唑磷添加浓度范围内均没有检测出阳性样品，灵敏度均低;除了产品2、产品4没有特异性之外，其他2种快速检测产品都有100%的特异性;产品3假阴性率为0，产品1的假阴性率为8.3%，产品2和产品4在三唑磷添加浓度范围内均没有检测出假阴性的结果;产品1和产品3的假阳性率为0，产品2和产品4在三唑磷添加浓度范围内均没有检测出假阳性的结果;产品3和产品1的相对准确度分别為100%和96.3%，产品2和产品4无法确定相对准确度。

由表5可知，在圆白菜样品中添加浓度为0～5 mg/kg的水胺硫磷，产品3检出限最低，为1 mg/kg，其次是产品1、产品2，均为3 mg/kg，检出限最高的是产品4，高于5 mg/kg;在27个圆白菜样品中，灵敏度最高的是产品3，为73.3%，其次是产品1、产品2，均为11.1%，产品4在水胺硫磷添加浓度范围内没有检测出阳性样品，灵敏度最低;除了产品4没有特异性之外，其他3种快速检测产品都有100%的特异性;假阴性率最低的是产品3，为26.7%，其次是产品1、产品2，均为88.9%;产品1、产品2、产品3的假阳性率均为0，产品4在水胺硫磷添加浓度范围内没有检测出假阴性样品和假阳性样品;相对准确度最高的为产品3，为85.2%，其次是产品1、产品2，均为70.4%，产品4在水胺硫磷添加浓度范围内没有检测出阳性样品，相对准确度最低。在苹果样品中添加浓度为0～5 mg/kg的水胺硫磷，产品3检出限最低，为1 mg/kg，产品1、产品2和产品4检出限均高于5 mg/kg;在27个苹果样品中，产品3灵敏度为46.7%，特异性为100%，假阴性率为53.3%，假阳性率为0，相对准确度为70.4%;产品1、产品2和产品4在水胺硫磷添加浓度范围内均没有检测出阳性样品，灵敏度均低，无检测特异性，无法判断假阴性、假阳性检测结果，也无法计算相对准确度。

由表3～5可知，4种基于酶抑制率法的快速检测产品（产品1、产品2、产品3、产品4）均不能满足GB 2763—2019中规定的果蔬中三唑磷（最大残留限量0.1～0.2 mg/kg）、水胺硫磷（最大残留限量0.02～0.05 mg/kg）最大残留限量的要求。

2.2 胶体金免疫层析法检测果蔬中农药残留

胶体金免疫层析法检测果蔬中的腈菌唑、三唑磷、水胺硫磷、氟虫腈、百菌清5种农药残留，检测结果如表6所示，在圆白菜和苹果中腈菌唑、三唑磷、水胺硫磷、氟虫腈、百菌清5种农药残留检出限分别为0.10、0.10、0.05、0.02、0.20 mg/kg。在样品总数均为27个的圆白菜、苹果样品中，在5种农药添加浓度范围内，灵敏度、特异性均为100%，没有假阴性、假阳性现象，相对准确度均为100%。

由表3和表6可知，胶体金免疫层析法检测果蔬中的腈菌唑、三唑磷、水胺硫磷、氟虫腈、百菌清5种农药残留均能够满足GB 2763—2019中规定的这5种农药在果蔬中最大残留限量的要求。

2.3 2种方法快速检测有机磷农药残留重复性

分别用产品1、产品2、产品3、产品4及胶体金试纸条测试圆白菜、苹果的空白样本、三唑磷和水胺硫磷添加浓度为 3 mg/kg 的加标阳性样本，每一水平3平行，POD 值如表7所示。结果显示，酶抑制率法的4种产品检测空白样品的重复性均无异常。产品1检测圆白菜中的三唑磷、水胺硫磷时重复性不好，检测苹果样品中水胺硫磷时灵敏度不够，没检出阳性样品。产品2检测圆白菜中的三唑磷、水胺硫磷时重复性不好，检测苹果中的三唑磷、水胺硫磷时灵敏度不够，没检出阳性样品。产品3检测圆白菜中的三唑磷、水胺硫磷时重复性较好，但检测苹果样品中水胺硫磷时重复性不好。产品4的灵敏度不够，没检出阳性样品。胶体金试纸条检测圆白菜、苹果的空白样本、三唑磷、水胺硫磷加标样本时重复性均无异常。

2.4 2种方法快速检测有机磷农药残留检出限

酶抑制率法与胶体金免疫层析法快速检测水胺硫磷、三唑磷2种有机磷农药残留检出限见表8。结果显示，胶体金免疫层析法检测圆白菜和苹果中水胺硫磷的检出限均为0.05 mg/kg，是酶抑制率法检测圆白菜和苹果中水胺硫磷的最低检出限1 mg/kg（最高检出限5 mg/kg）的20倍（100倍以上），胶体金免疫层析法检测圆白菜和苹果中三唑磷的检出限均为0.10 mg/kg，是酶抑制率法检测圆白菜（苹果）中三唑磷的最低检出限2 mg/kg（1 mg/kg）的20倍（10倍），是酶抑制率法检测圆白菜（苹果）中三唑磷的最高检出限（>5 mg/kg）的50倍。

2.5 2种方法快速检测有机磷农药残留灵敏度

运用胶体金免疫层析法（胶体金试纸条）与酶抑制率法（产品1、产品2、产品3、产品4）的快速检测产品检测圆白菜、苹果中2种有机磷农药（水胺硫磷、三唑磷）残留，在添加浓度范围内方法灵敏度如表9所示。胶体金免疫层析法检测圆白菜、苹果样品中水胺硫磷、三唑磷的灵敏度均为100%，其次是产品3、产品1、产品2，产品4的检测限高于添加浓度5 mg/kg，没有阳性结果的样品，灵敏度最低。

2.6 2种方法快速检测有机磷农药残留特异性

酶抑制率法与胶体金免疫层析法快速检测水胺硫磷、三唑磷2种有机磷农药残留特异性见表10。结果显示，酶抑制率法的产品3检测圆白菜、苹果中2种有机磷农药残留特异性均为100%;产品1在检测圆白菜中2种有机磷农药时特异性均为100%，检测苹果中水胺硫磷时，特异性无法确定;产品2在检测圆白菜中2种有机磷农药时特异性均为100%，检测苹果中2种有机磷农药时特异性无法确定;产品4在检测圆白菜、苹果中2种有机磷农药时特异性均为无法确定。胶体金免疫层析法检测圆白菜、苹果中2种有机磷农药残留特异性均为100%。

2.7 2种方法快速检测有机磷农药残留假阴性

酶抑制率法与胶体金免疫层析法快速检测水胺硫磷、三唑磷2种有机磷农药残留假阴性见表11。结果显示，酶抑制率法的产品1、产品2、产品3在检测圆白菜、苹果中2种有机磷农药残留时均有不同程度的假阴性现象，产品4不能确定阳性样品数，因此不能确定假阴性。胶体金免疫层析法检测圆白菜、苹果中2种有机磷农药残留时均无假阴性现象。

2.8 2种方法快速检测有机磷农药残留假阳性

酶抑制率法与胶体金免疫层析法快速检测水胺硫磷、三唑磷2种有机磷农药残留假阴性见表12。结果显示，酶抑制率法的产品3在检测圆白菜、苹果中2种有机磷农药残留时均无假阳性现象，产品1、产品2均有不同程度的假阳性现象，产品4不能确定假阳性。胶体金免疫层析法检测圆白菜、苹果中2种有机磷农药残留时均无假阳性现象。

2.9 2种方法快速检测有机磷农药残留相对准确度

酶抑制率法与胶体金免疫层析法快速检测水胺硫磷、三唑磷2种有机磷农药残留相对准确度见表13。结果显示，酶抑制率法的产品3在检测圆白菜、苹果中2种有机磷农药残留时相对准确度在70.4%～100%，产品1、产品2次之，产品4无法确定相对准确度。胶体金免疫层析法检测圆白菜、苹果中2种有机磷农药残留时相对准确度均为100%。

2.10 酶抑制率法与胶体金免疫层析法比较

基于酶抑制率法农药残留快速检测技术的GB/T 5009.199—2003标准自2004年1月1日实施以来，广泛应用于我国蔬菜中农药残留现场快速检测上。但酶抑制率法测定样品仅限于蔬菜（实际也用于水果检测），只能进行大类检测（有机磷和氨基甲酸酯类），针对性不强，不易暴露风险;检测结果易受检测环境温度影响;操作较复杂;不同产品的重复性存在较大差异;检出限不能满足GB 2763—2019中规定的最大残留限量要求[15-17];不同产品的灵敏度、特异性存在较大差异，存在假阳性、假阴性现象，相对准确度总体不高（表14）。胶体金免疫层析法能进行单项检测，针对性强，易暴露风险;检测时间仅需12 min，比酶抑制率法（25 min）快1倍;能在室温下检测，受检测环境温度影响较小;操作简单;产品重复性好，能满足GB 2763—2019中规定的最大残留限量要求;可作为半定量检测方法应用于筛查检测[18];产品灵敏度高、特异性好，无假阴性、假阳性现象，相对准确度为100%（表14）。

3 结论与讨论

3.1 酶抑制率法

该方法只能进行有机磷和氨基甲酸酯类检测，不易暴露风险。不同产品的灵敏度、特异性存在较大差异，存在假阳性、假阴性现象，相对准确度总体不高。此外，稳定性、重复性较差，而且检出限远高于GB 2763—2019中规定的食品中农药最大残留限量的要求，作为快速筛查农药残留方法没有实在意义。

3.2 胶体金免疫层析法

作為一种快速筛查手段，与酶抑制率法（GB/T 5009.199—2003标准）相比，该方法能进行单项检测，针对性强，易暴露风险。该方法稳定性好、灵敏度高，无假阳性和假阴性现象，相对准确度高。此外，该方法检出限能满足GB 2763—2019中规定的食品中农药最大残留限量等特点，可配合“食用农产品合格证制度”实施，广泛用于果蔬生产者自检以及农贸市场、餐饮单位、超市等对果蔬的进货把关，为基层监管部门现场抽检筛查提供快速检测服务，能够很好地解决当前实验室定量检测力量达不到农产品和食品抽检量（4批次/千人）监测需求的问题。

酶抑制率法Enzyme inhibition rate method大类检测（有机磷和氨基甲酸酯类），不易暴露风险2537 ℃，易受检测环境温度影响不能满足GB 2763—2019中规定的最大残留限量要求操作较复杂，需要专业水平不同产品检测不同样品阳性结果的重复性存在较大差异不同产品的灵敏度、特异性存在较大差异，存在假阳性假阴性现象，相对准确度总体不高

胶体金免疫层析法Colloidal gold immunochromatography method单项检测，针对性强，易暴露风险1220～25 ℃，受检测环境温度影响较小可满足GB 2763—2019中规定的最大残留限量要求易操作，技术要求低 重复性100% 灵敏度高、特异性好，无假阴性、假阳性现象，相对准确度为100%

农药快速检测技术与其他新技术结合，实现高灵敏度、选择性和稳定性，快速化、集成化和微型化，是农药残留快速检测的未来发展方向。胶体金快速检测试纸条已经向同一试纸条能检测多种农药残留方面发展，目前已有这方面报道[19-22]。此外，酶抑制法国家标准GB/T 5009.199—2003作为目前农药残留快速检测的主流技术，应当尽快修改，为农产品质量安全提供可靠保障。

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