柳叶亚菊挥发油对烟草甲与赤拟谷盗的毒杀作用

杨盈盈，邵亚洲，石毛宁，徐 婕，梁俊玉

西北师范大学生命科学学院，兰州市安宁区安宁东路967 号 730070

烟草甲（Lasioderma serricorne）属鞘翅目窃蠹科昆虫，是最常见的仓储害虫之一。烟草甲的食性复杂，在农作物仓库对谷物和豆类具有严重的为害性；在烟草仓库中对储藏的雪茄、卷烟和烟叶等也有很大的为害［1］。在20 世纪90 年代，我国曾对为害全国贮烟害虫的为害程度进行了调查，发现全国每年因贮烟害虫造成的烟叶质量损失率为1.64%［2-3］。赤拟谷盗（Tribolium castaneum）属鞘翅目拟步甲科，对水稻、小麦、玉米等各类粮、油、肉类及其加工制品等都可造成严重为害［4］。其为害周期长，繁殖速度快，且成虫身体上的臭腺会分泌物质容易导致物质结块并使其颜色发生变化，发出腥霉味臭气，且其分泌物中含有致癌物苯醌［5-6］。目前,防治烟草甲和赤拟谷盗的方法主要是使用化学合成杀虫剂—磷化氢熏蒸［7］。虽然化学杀虫剂具有很好的毒杀效果，但长期使用会危及人类健康并对环境造成污染，且会增加烟草甲和赤拟谷盗的抗药性［8-9］。因此，寻找可代替化学杀虫剂的新型农药十分重要。

近年来新型植物源杀虫剂的研发受到了人们的高度重视。其中，植物挥发油具有抑菌消炎、抗氧化、驱蚊杀虫等功效，有开发成天然抑菌剂、抗氧化剂以及杀虫剂等的潜力［10］；且具有对环境无害、毒性较低、对非靶标生物无害、对人畜安全、易于分解且对害虫不易产生抗性等特点［11］。目前关于植物挥发油对烟草甲和赤拟谷盗的触杀和熏蒸活性已有较多研究，鞠克升［12］报道了珠光香青（Anaphalis margaritacea）挥发油对赤拟谷盗的触杀活性（LD50为41.25 μg/头）。吴彦等［13］研究提出了侧柏（Platycladus orientalis）挥发油对赤拟谷盗和烟草甲具有触杀活性（LD50分别为48.58 μ g/头和50.45 μg/头）和熏蒸活性（LC50分别为145.40 mg/L和39.25 mg/L）。张莉娟等［14］试验发现头花杜鹃（Rhododendron capitatum）挥发油对赤拟谷盗（LD50为104.92 μg/头）和烟草甲（LD50为44.40 μg/头）有触杀活性。Yang 等［15］研 究 表 明 山 苍 子 果 实（Litsea cubeba）挥发油对烟草甲有熏蒸活性（LC50为22.97mg/L）。程昉等［16］报道了牛尾蒿（Artemisia dubia）、灰苞蒿（A.rocburghiana）、红足蒿（A.rubripes）、白莲蒿（A.sacrorum）和华北米蒿（A.giraldii）等5 种蒿属植物挥发油对烟草甲和嗜卷书虱有驱避活性，其中红足蒿挥发油对烟草甲的驱避活性最好，牛尾蒿挥发油对嗜卷书虱的驱避活性最显著。

许多亚菊属植物都具有消炎止血、清热解毒、驱蚊杀虫、消炎止痒等药理作用，并且许多亚菊属植物中含有挥发油［17］。有研究表明，细叶亚菊（Ajania tenuifolia）、川甘亚菊（Ajania potaninii）、光苞 亚 菊（Ajania nitida）和 丝 裂 亚 菊（Ajania nematoloba）等的挥发油对烟草甲（Lasioderma serricorne）和赤拟谷盗有触杀、熏蒸和驱避活性［3,18-19］，其中光苞亚菊挥发油对烟草甲的触杀活性最强。Liang 等［20］试验认为灌木亚菊（Ajania fruticulosa）挥发油对赤拟谷盗和嗜卷书虱（Liposcelis bostrychophila）均有触杀和驱避活性。王思敏等［21］提出了铺散亚菊（Ajania khartensis）挥发油对马铃薯茎线虫（Ditylenchus destructor）具有较强的触杀作用。柳叶亚菊（Ajania salicifolid）可用于清热解毒、清肺止咳和防虫驱蚊［22-23］。目前有关柳叶亚菊挥发油对烟草甲和赤拟谷盗杀虫活性的影响尚鲜见报道。为此，设置了柳叶亚菊挥发油的化学成分分析及其对两种常见仓储害虫的毒杀作用试验，以期为仓储害虫的绿色防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料采集和挥发油提取

柳叶亚菊（Ajania salicifolia）于2018 年8 月采自甘肃省兰州市榆中县（经纬度35°78′34″N，103°93′79″E，海拔3 200 m）。将柳叶亚菊植物的地上部分阴干、粉碎、称取1 000 g 后转移到挥发油提取器中。经过6 h 蒸馏提取后收集挥发油，残留水分用无水硫酸钠去除，得到挥发油。将提取得到的柳叶亚菊挥发油装入玻璃小瓶中，密封后放到4 ℃冰箱中保存。

1.2 供试昆虫

将烟草甲和赤拟谷盗饲养在容积为0.5 L 的玻璃瓶中，饲以10∶1 质量比混合的小麦粉与酵母粉。培养温度为（29±1）℃，相对湿度为70%～80%。试验昆虫（试虫）为羽化后1～2 周的成虫，不分雌雄。

1.3 仪器与试剂

6890N 气相色谱分析仪（美国Agilent 公司），配有5973N 质谱分析仪，氢火焰离子化检测器（GC-FID），NIST2.0 质谱数据库；移液枪（量程范围：0.1～2.5、0.5～10 和10～100 μL，大龙兴创实验仪器有限公司）；正己烷（分析纯，烟台市双双化工有限公司）；除虫菊酯（纯度27%，陕西米尔康生物科技有限公司）；避蚊胺（DEET，纯度99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；玻璃样品瓶、玻璃培养皿购于北京玻璃仪器厂。

1.4 柳叶亚菊挥发油GC/MS 分析

样品前处理：将提取得到的柳叶亚菊挥发油经正己烷萃取，无水硫酸钠处理后过滤，常压浓缩至不含溶剂，对得到的无色挥发油进行GC/MS分析。

GC/MS 条件：色谱柱为熔融石英毛细管柱HP-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)。气相色谱升温程序为：初始温度，保持15 min。用正己烷将柳叶亚菊挥发油溶解，稀释至1%（体积分数）注射到气相色谱仪中。气相色谱参数：汽化室温度250 ℃；载气为高纯氦气；进样量1 μL；流速1.0 mL/min；分流比1∶10。质谱参数：电离方式为EI电离；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；质量扫描范围20～550 m/z。最后采用与正构烷烃（C8～C24）的保留时间和质谱数据库（NIST 2.0 和Wiley 275 libraries）数据比较鉴定挥发油组分。采用峰面积归一化法，根据各化学成分的分子量，计算出各化学成分在挥发油中的相对含量。

1.5 生物活性的测定

1.5.1 触杀活性

参考文献［24］的方法测定柳叶亚菊挥发油对烟草甲和赤拟谷盗的触杀活性。将试虫放在培养皿中并置于冰袋上，用移液枪取0.5 μL 样品的正己烷稀释液分别滴于停止行动的2 种试虫前胸背板上，用药后放入直径2.5 cm，高5.5 cm 的玻璃瓶中。正己烷为空白对照，除虫菊酯（浓度分别为0.200 0%、0.100 0%、0.050 0%、0.025 0%和0.012 5%，体积分数）为阳性对照，样品设置5 个浓度梯度（15.00%、10.00%、6.67%、4.50%和2.98%，体积分数），每个浓度重复5 次，每次重复试虫10 头。处理后置于温度（29±1）℃，相对湿度为70%～80%的恒温培养箱中暗培养24 h，观察记录试虫死亡情况，并计算死亡率与校正死亡率，采用SPSS 22.0统计软件分析计算半致死剂量LD50（μg /头）。

1.5.2 熏蒸活性

参考文献［25］的方法测定柳叶亚菊挥发油对烟草甲和赤拟谷盗熏蒸活性。将试虫放入玻璃瓶中，用正己烷将柳叶亚菊挥发油配制成5 个浓度梯度（50.000%、25.000%、12.500%、6.250%和3.125%，体积分数）的稀释溶液。用移液枪取10μL 的稀释溶液，滴在覆盖于瓶盖内顶部直径为2 cm 的滤纸片上,待溶剂挥发20 s 后，迅速将瓶盖拧紧并密闭。正己烷为空白对照，甲基溴［20］和磷化氢［15］分别作为赤拟谷盗和烟草甲熏蒸活性的阳性对照。每个浓度重复5 次，每次重复试虫10头。处理后置于温度（29±1）℃，相对湿度70%～80%的恒温培养箱中暗培养24 h，观察记录死亡情况，并采用SPSS 22.0 统计软件分析计算半数致死浓度LC50（mg/L）。

1.5.3 驱避活性

参考文献［26］的方法测定柳叶亚菊挥发油对烟草甲和赤拟谷盗的驱避活性。用正己烷溶解柳叶亚菊挥发油并制成5 个连续浓度（0.500 0%、0.100 0%、0.020 0%、0.004 0%和0.000 8%，体积分数）梯度的溶液。取与培养皿（直径9 cm，高1.9cm）底相同直径的滤纸，沿着中线对半剪开，一半滴加500 μL 稀释溶液，另一半滴加等量正己烷作为空白对照。待溶剂自然挥发后，立即用固体胶将处理过的滤纸相向紧贴在培养皿底部，注意粘牢不留缝隙，以防止试虫钻入滤纸下面，影响观察效果。将20 头试虫从培养皿中央投入，迅速盖上培养皿盖子并密封。不同浓度的样品用相同的方法处理5 次。避蚊胺作为阳性对照。在处理2 h和4 h 后分别统计出现在不同区域内的试虫数量。并计算驱避率（Percentage repellency，PR）。

式中：Nc表示出现在阴性对照区域内的试虫数量，头；Nt表示出现在实验组区域内的试虫数量，头。计算出PR 的平均值±标准误。

1.5.4 数据处理

利用Abbott’s formula 软件计算校正死亡率。采用IBM SPSS V22.0 统计软件计算触杀活性的半致死剂量（LD50）和熏蒸活性的半数致死浓度（LC50）。采用方差分析法，用IBM SPSS V22.0 软件进行数据分析。

2 结果与讨论

2.1 柳叶亚菊挥发油的化学成分分析

柳叶亚菊挥发油的GC/MS 分析结果见表1。从柳叶亚菊挥发油中鉴定出了23 种化合物，占挥发油总量的96.13% 。 其主要成分为樟脑（36.50%）、杜松脑(16.44%)、桉叶油醇（9.61%）和α-红没药醇（4.77%）。化合物类型以烯、醇和酮等为主。

2.2 触杀活性

柳叶亚菊挥发油对烟草甲和赤拟谷盗的触杀活性见表2。柳叶亚菊挥发油对赤拟谷盗和烟草甲具有一定的触杀作用，LD50分别为64.51 μg/头和25.66 μg/头。柳叶亚菊挥发油对烟草甲的触杀活性高于赤拟谷盗2.5 倍，因此柳叶亚菊挥发油对烟草甲表现出较强的触杀活性，但柳叶亚菊挥发油对烟草甲和赤拟谷盗的触杀活性弱于药剂对照。柳叶亚菊挥发油对烟草甲和赤拟谷盗触杀作用存在差异，这可能与挥发油组成成分以及两种昆虫体内的某些酶有关。与鞠克升等［12］、吴彦等［13］和张莉娟等［14］对珠光香青挥发油、侧柏挥发油和头花杜鹃挥发油对烟草甲与赤拟谷盗的触杀活性研究结果相比，柳叶亚菊挥发油对烟草甲的触杀活性强于侧柏挥发油和头花杜鹃挥发油。另外，本研究中只测试了柳叶亚菊挥发油对烟草甲和赤拟谷盗成虫的杀灭活性，而对其幼虫和卵的杀灭活性还需进一步试验。

表1 柳叶亚菊挥发油的化学成分及相对含量Tab.1 Chemical compositions and their relative contents in A. salicifolid essential oil

表2 柳叶亚菊挥发油对烟草甲和赤拟谷盗的触杀活性①②Tab.2 Contact toxicity of A. salicifolid essential oil against L. serricorne and T. castaneum

2.3 熏蒸活性

柳叶亚菊挥发油对赤拟谷盗和烟草甲的熏蒸活性见表3。柳叶亚菊挥发油对烟草甲和赤拟谷盗具有较强的熏蒸活性，LC50分别为26.60 mg/L 和24.29 mg/L。虽然柳叶亚菊挥发油对烟草甲和赤拟谷盗的熏蒸活性弱于药剂对照，但与吴彦等［13］和Yang 等［15］对侧柏挥发油和山苍子挥发油对烟草甲和赤拟谷盗的熏蒸活性研究结果相比，柳叶亚菊挥发油对赤拟谷盗的熏蒸活性优于侧柏挥发油，对烟草甲的熏蒸活性也优于侧柏挥发油，而与山苍子果实挥发油的熏蒸活性相近。

表3 柳叶亚菊挥发油对烟草甲和赤拟谷盗的熏蒸活性①Tab.3 Fumigant activity of A. salicifolid essential oil against L. serricorne and T. castaneum

2.4 驱避活性

柳叶亚菊挥发油对两种害虫的驱避活性见表4。结果表明，柳叶亚菊挥发油对烟草甲和赤拟谷盗具有一定的驱避活性，但对赤拟谷盗的驱避活性更明显。使用浓度0.500 0%时，其处理2 h 和4 h 后对赤拟谷盗的驱避率高于90%，且与避蚊胺的驱避活性相近。使用浓度0.100 0%和0.020 0%时，处理4 h 后挥发油对赤拟谷盗驱避活性比处理2 h 后的驱避活性略好，均与避蚊胺的驱避活性相近；处理浓度0.000 8%时，处理2 h 和4 h 后对赤拟谷盗的驱避效果与避蚊胺相当。可见高测试浓度时柳叶亚菊挥发油对烟草甲的驱避率在60%以上，驱避活性较强；低浓度下，对烟草甲的驱避活性较弱。

表4 柳叶亚菊挥发油和避蚊胺对烟草甲和赤拟谷盗的驱避活性①Tab.4 Repellent activity of A. salicifolid essential oil and DEET against L. serricorne and T. castaneum

3 结论

柳叶亚菊挥发油的主要成分为单萜和倍半萜，其中单萜类化合物占绝大多数，主要以樟脑、杜松脑和桉叶油醇为主。柳叶亚菊挥发油对烟草甲和赤拟谷盗触杀活性LD50分别为25.66 µg/头和64.51 µg/头，对烟草甲的触杀活性明显强于赤拟谷盗。柳叶亚菊挥发油对烟草甲和赤拟谷盗熏蒸活性LC50分别为26.60 mg/L 和24.29 mg/L，对两种试虫均具有显著的熏蒸作用效果。在高浓度（0.500 0%）条件下分别处理2 h 和4 h 后柳叶亚菊挥发油对烟草甲的驱避率高于60%，对赤拟谷盗的驱避率高于90%。因此，柳叶亚菊挥发油对烟草甲和赤拟谷盗均具有较显著的防治效果，具有开发为新型植物源烟草仓储害虫杀虫剂的潜质。