基于离子液体微波辅助萃取牡丹皮中丹皮酚的含量测定*

吴 晟

(安徽中医药高等专科学校，安徽 芜湖 241000)

牡丹是芍药科(Paeoniaeeae)芍药属(Paeonia)植物，主要分布在安徽、山东、四川等地。牡丹皮是牡丹的干燥根皮[1]，为临床常用中药之一。相关研究发现：牡丹皮中含有17种单萜类成分、11种鞣质成分、8种酚酸类成分等48种成分[2]，其中的丹皮酚在临床上多用于治疗风湿痛、心脑血管、肿瘤及免疫系统等疾病[3-4]。

离子液体(Ionic Liquid，IL)是在室温或近室温时由体积较大、结构不对称的有机阳离子和体积较小的无机/有机阴离子组成的液态物质[5]。与传统溶剂相比，IL具有热稳定性好、不挥发、便于重复利用等特点[6-8]。由于IL对目标物选择性高，因此能够有效提取天然产物中的微量活性成分，目前IL已成为萃取分离领域的一种新型绿色溶剂。微波辅助萃取(Microwave Assisted Extraction，MAE)，是凭借微波对萃取体系中不同组分具有选择性加热的能力，使被萃取物从体系中分离的方法。该法试剂用量少、节能省时、产量大[9]，已被广泛应用于天然药物、食品的萃取和分析。

以IL作为溶剂或共溶剂参与微波辅助萃取，能更好发挥两者的优势。IL对微波吸收效果好，热转化能力强[10-11]，因此加热速率快，可极大缩短萃取时间，且两者结合更有利于目标物从体系分离，因此，IL微波辅助萃取是一种高效、绿色、安全的提取方法。本实验以丹皮酚得率为指标，利用单因素实验对IL微波辅助萃取牡丹皮过程中影响丹皮酚得率的主要因素液固比、pH值、提取温度、提取功率、提取时间和IL浓度进行优化，旨在筛选出提取牡丹皮中丹皮酚的最优条件。

1 材料与仪器

1.1 材料、试剂

牡丹皮，2019年采收于安徽铜陵，自然晾干后粉碎过60目，干燥保存。丹皮酚对照品购置于中国药品生物制品鉴定所；1-丁基-3-甲基咪唑溴盐([Bmin]Br)(纯度≥98%)，阿拉丁公司；甲醇、乙腈均为色谱纯；其余试剂均为分析纯；蒸馏水(18.2 MW)。

1.2 仪 器

Agilent 1100型反相高效液相色谱仪，美国Agilent公司；Eppendorf AG 22331 Hamburg离心机，德国Eppendorf公司；Hi-Tech水纯化系统(18.2 MW)，上海和泰仪器有限公司；XH-100A电脑微波催化/合成萃取仪，北京祥鹄科技发展有限公司；HE-2078分析型电子天平，北京赛多利斯公司。

2 实验方法

2.1 HPLC条件

采用Waters XTerra MS C18柱(4 mm，2.1×250 mm)色谱柱，流动相为甲醇-水(0.05%甲酸)=95:5(V/V)，等度洗脱，流速0.2 mL/min；进样量为20 μL，检测波长：274 nm，柱温25 ℃，分析时间30 min。

2.2 标准曲线绘制

精密称取牡丹皮对照品10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用乙醇溶解并稀释定容至刻度，制成浓度为1.0 mg/mL牡丹皮对照品储备液。加乙醇制备成不同浓度的标准溶液，使之成为浓度为0.8、1.6、8.0、16.0、80.0、400.0 μg/mL的系列标准工作溶液，按上述“2.1”项所述色谱条件进样。以峰面积(y)为纵坐标，浓度(x)为横坐标作标准曲线图并进行线性拟合。

2.3 牡丹皮中丹皮酚提取流程及含量测定

分别取牡丹皮样品粉末0.5 g，置于250 mL锥形瓶中，加入一定体积的IL水溶液，调节pH值，设定不同温度、不同功率，提取一定时间。取适量提取液在25 ℃、转速3000 r/min条件下离心10 min，取20 μL上清液进行HPLC检测。

得率计算公式：

(1)

式中：Y是得率，mg/g；C是丹皮酚浓度，mg/mL；V是提取液体积，mL；M是原料重量，g。

2.4 单因素实验

离子液体([Bmin]Br)水溶液微波辅助萃取牡丹皮中丹皮酚的主要影响因素有液固比、pH值、提取温度、提取功率、提取时间和IL浓度。

2.4.1 液固比

称取牡丹皮样品粉末0.5 g，按照液固比8:1、10:1、12:1、15:1、20:1、25:1、30:1，加入0.5 mol/L的IL水溶液，调节pH值为6，设定温度70 ℃，微波功率600 W，提取时间10 min，提取液离心后，经HPLC检测并计算得率。

2.4.2 pH值

称取牡丹皮样品粉末0.5 g，按照液固比15:1，加入0.5 mol/L的IL水溶液，调节pH值分别为4、5、6、7、8、9、10，设定温度70 ℃，微波功率600 W，提取时间10 min，提取液离心后，经HPLC检测并计算得率。

2.4.3 提取温度

称取牡丹皮样品粉末0.5 g，按照液固比15:1，加入0.5 mol/L的IL水溶液，调节pH值为6，设定温度分别为50、60、70、80、90 ℃，微波功率600 W，提取时间10 min，提取液离心后，经HPLC检测并计算得率。

2.4.4 提取功率

称取牡丹皮样品粉末0.5 g，按照液固比15:1，加入0.5 mol/L的IL水溶液，调节pH值为6，设定温度70 ℃，微波功率分别为200、300、400、500、600、700、800 W，提取时间10 min，提取液离心后，经HPLC检测并计算得率。

2.4.5 提取时间

称取牡丹皮样品粉末0.5 g，按照液固比15:1，加入0.5 mol/L的IL水溶液，调节pH值为6，设定温度70 ℃，微波功率600 W，提取时间8、10、12、15、20、25、30 min，提取液离心后，经HPLC检测计算得率。

2.4.6 IL浓度

称取牡丹皮样品粉末0.5 g，按照液固比15:1，加入0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.2、1.5 mol/L的IL水溶液，调节pH值为6，设定温度70 ℃，微波功率600 W，提取时间10 min，提取液离心后，经HPLC检测并计算得率。

2.5 方法验证

称取牡丹皮样品粉末0.5 g，按照液固比15:1，加入0.5 mol/L的IL水溶液，调节pH值为6，设定温度70 ℃，微波功率600 W，提取时间10 min，提取液离心后，经HPLC检测并计算得率。以此来验证在牡丹皮在上述条件下提取的稳定性。

3 结果与讨论

3.1 标准曲线的确证

按照“2.2”项下操作，得到回归方程为：A=35146X-2975.8(R2=0.9999，n=6)，结果表明丹皮酚在0.8～400.0 mg/mL范围内浓度与峰面积线性关系良好。

3.2 单因素对牡丹皮中丹皮酚得率的影响

3.2.1 液固比对得率的影响

设定温度70 ℃，微波功率600 W，提取时间10 min，调节pH值为6，以0.5 mol/L的IL水溶液按照不同液固比对丹皮酚的提取得率详见表1。可以看出随着液固比的增加，丹皮酚的得率逐渐增加，当液固比达到15:1，丹皮酚的得率达到最高，以后得率呈现逐渐下降的趋势，主要原因可能是达到一定程度液固比后，样品已被提取的非常充分，再增大将不能获得更高的得率，综合考虑选择(15:1)作为实验的最优液固比。

表1 不同液固比对丹皮酚得率的影响

3.2.2 pH值对得率的影响

按照液固比达到15:1，设定温度70 ℃，微波功率600 W，提取时间10 min，以0.5 mol/L的IL水溶液，按照不同的pH值，对丹皮酚的提取得率详见表2。可以看出在弱碱性(pH=9)丹皮酚的得率最高。可能是因为丹皮酚显弱酸性，在碱性条件下能有较大的溶解度，但碱性过强会导致丹皮酚发生缩合等反应，综合考虑选择pH=9作为最优pH值。

表2 不同pH值对丹皮酚得率的影响

3.2.3 提取温度对得率的影响

按照液固比15:1，微波功率600 W，提取时间10 min，调节pH值为6，以0.5 mol/L的IL水溶液按照不同的提取温度，对丹皮酚的提取得率详见表3。随着温度的升高，得率逐渐上升，当温度达到70 ℃时，得率达到0.0717%，80～90 ℃得率下降不大，可能是由于70 ℃时候IL与药液接触最充分，药液分子分子间作用力最大，活化能最大，提取效率高。综合考虑选择70 ℃为最佳提取温度。

表3 不同提取温度对丹皮酚得率的影响

3.2.4 提取功率对得率的影响

按照液固比15:1，设定温度70 ℃，提取时间10 min，调节pH值为6，以0.5 mol/L的IL水溶液按照不同的提取功率，对丹皮酚的提取得率详见表4。通过表4可以看出：提取功率在(200～500)W之间，丹皮酚的得率没有显著变化，但提取功率增大到600 W时，丹皮酚得率最大，(700～800)W丹皮酚得率降低。可能是由于功率达到(700～800)W，使得丹皮酚发生降解反应。综合考虑选择600 W为最佳提取功率。

表4 不同提取功率对丹皮酚得率的影响

3.2.5 提取时间对得率的影响

按照液固比15:1，设定温度70 ℃，微波功率600 W，调节pH值为6，以0.5 mol/L的IL水溶液按照不同的提取时间，对丹皮酚的提取得率详见表5。通过表5可以看出：在一定范围内，随着提取时间的延长，丹皮酚得率在增加，当提取时间超过10 min时，丹皮酚得率降低。综合考虑选择10 min为最佳提取时间。

表5 不同提取时间对丹皮酚得率的影响

3.2.6 IL浓度对得率的影响

按照液固比15:1，设定温度70 ℃，微波功率600 W，调节pH值为6，提取时间10 min，以不同浓度的IL水溶液，对丹皮酚的提取得率详见表6。可以看出：当IL浓度为0.5 mol/L时，丹皮酚得率最大。可能是由于当IL浓度=0.5 mol/L时，IL与丹皮酚有效接触面积最大，反应最充分。综合考虑选择IL浓度=0.5 mol/L为最佳提取IL浓度。

表6 不同IL浓度对丹皮酚得率的影响

3.3 方法验证

3.3.1 稳定性的研究

在上述单因素得到的最优条件下，采用IL结合微波辅助提取牡丹皮中丹皮酚后，丹皮酚的回收率为99.2%，放置7天后，丹皮酚的回收率为97.5%，结果说明丹皮酚在IL结合微波辅助萃取方法中稳定性较好。

3.3.2 回收率的研究

在上述单因素得到的最优条件下，采用IL结合微波辅助提取牡丹皮中丹皮酚后，丹皮酚的回收率为98.3%，放置7天后，丹皮酚的回收率为97.1%，结果说明丹皮酚在IL结合微波辅助萃取方法中回收率较高。

3.3.3 重复性的研究

称取5份0.5 g牡丹皮，在上述单因素得到的最优条件下，采用IL结合微波辅助提取牡丹皮中丹皮酚后，丹皮酚的相对标准偏差为4.3%，结果说明牡丹皮中丹皮酚在IL结合微波辅助萃取方法中重新性较好。

4 结 论

本实验采用IL结合微波辅助提取牡丹皮中的丹皮酚，通过对影响提取过程中的几个关键因素(如：液固比、pH值、提取时间、提取温度、提取功率、IL浓度等)进行单因素考察，最终筛选出最优提取条件。最佳提取条件为：液固比15:1、pH=9、提取温度70 ℃、提取功率600 W、提取时间10 min、IL浓度0.5 mol/L，丹皮酚的得率为0.48 mg/g，高于传统使用乙醇作溶剂的得率。因此，IL结合微波辅助提取牡丹皮中的丹皮酚是一种高效、可靠、有前途的提取方法。