转基因玉米双抗12-5-21的抗虫性及对草甘膦的耐受性

孙红炜， 徐晓辉， 李 凡， 杨淑珂， 路兴波

山东省农业科学院植物保护研究所/山东省植物病毒学重点实验室，山东 济南 250100

玉米ZeamaysL.是我国重要的粮食作物及工业加工原料，在我国农作物生产中占有重要的位置。虫害是影响玉米产量的重要因素。我国主要的玉米害虫有亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Guenee)、黏虫Mythimnaseparate(Walker)、棉铃虫HelicoverpaarmigeraHübner等鳞翅目害虫。亚洲玉米螟常年发生，给玉米生产造成一定的损失，被害玉米一般减产10%～20%，严重年份达50%以上(王红军和郭书亚，2017)。黏虫一般年份发生不重，但在适宜的环境中会突然大暴发，如2012年8月上旬，在河北省廊坊、唐山等，北京通州、昌平，内蒙古通辽、赤峰，辽宁朝阳、阜新，吉林长春、松原，黑龙江哈尔滨，天津和山西晋中等地3代黏虫幼虫相继暴发，发生面积374万hm2，严重发生面积54.5万hm2，对玉米、谷子、水稻等粮食作物生产安全造成了严重威胁(张云慧等，2012)。

我国害虫防治一直提倡预防为主、综合防控，但现阶段主要依赖化学防治。化学防治虽然效果较好，但防治时间滞后，无法控制实际减产，另外,环境污染、食品污染严重，浪费大量人力、物力。而转基因作物由于自身持续表达抗性蛋白，可以在害虫发生早期对其进行有效控制，避免害虫大发生。

到目前为止，我国未批准任何转基因玉米种植，但在2008年开始实施的转基因生物新品种培育重大专项支持下，我国每年都有众多转基因玉米进入中间试验、环境释放试验或生产性试验，目前国内不少种子公司已培育出抗虫耐除草剂效果较好的转基因玉米品种(戴军等，2014； 刘洋等，2016； 王慧等，2014； 张琪等，2010)。其中，转植酸酶玉米于2009年获得安全证书，2019年，抗虫抗除草剂玉米DBN9936、双抗12-5也获得安全证书。因此，从技术储备、玉米经济地位、病虫预防需求及除草剂安全应用各方面看，玉米是最适合在我国首先批准释放的转基因作物(李宁等，2011； 沈平等，2016； 张彦琴等，2016)。转基因玉米双抗12-5是浙江大学研发的含有抗虫基因cry1Ab/cry2Aj与耐除草剂基因G10evo的转基因玉米新品系，其中，cry1Ab/cry2Aj表达Bt杀虫蛋白，对亚洲玉米螟有较高的杀虫活性，对其他鳞翅目害虫也有一定的控制作用(常雪等，2013； 孙红炜等，2018)，草甘膦靶标酶基因G10evo对草甘膦有很高的耐受性(谭苗苗，2016)。本研究对转基因玉米双抗12-5的杂交后代双抗12-5-21对3种鳞翅目害虫抗性及对靶标除草剂草甘膦的耐受性进行了鉴定，以期为转基因玉米双抗12-5的推广应用提供科学的基础数据。

1 材料与方法

1.1 供试玉米

双抗12-5-21(转基因抗虫耐除草剂玉米)、综31(非转基因玉米，感虫对照品种)、郑单958(非转基因玉米，当地对照品种，与双抗12-5-21具有相同的杂交亲本)，其中，双抗12-5-21由浙江大学提供，综31由中国农业科学院作物研究所提供，郑单958购自当地种子市场。

1.2 田间抗虫性鉴定

供试昆虫亚洲玉米螟、黏虫、棉铃虫均由本研究室人工繁殖。参照农业部953号公告-10.1-2007及农业部标准NY/T 1248.5-2006进行试验。

亚洲玉米螟：在玉米6叶期和吐丝期人工接种初孵幼虫，选择傍晚接虫。心叶期接种到心叶内，吐丝期接种到花丝上。每小区人工定株接虫40株，每株接虫30～40头。3 d后进行第2次接虫，最后一次接虫14 d后调查。

心叶期调查：调查接虫株中上部叶片被亚洲玉米螟危害程度，包括受害叶片上的虫孔大小、数量及分布等，记录食叶级别，计算平均食叶级别，根据平均食叶级别判定玉米心叶期对亚洲玉米螟的抗性水平。危害程度分级标准及抗性评价标准参照农业部标准NY/T 1248.5-2006。

吐丝期调查：根据雌穗被害情况、蛀孔数量、隧道长度(cm)及存活幼虫龄期数量等，计算各小区穗期亚洲玉米螟对雌穗的被害级别平均值。按照雌穗被害级别平均值判定玉米穗期对亚洲玉米螟的抗性水平。雌穗被害级别分级标准及抗性评价标准参照农业部953号公告-10.1-2007。

黏虫：玉米6叶期接虫，接虫方法及接虫次数同亚洲玉米螟。最后一次接虫14 d后调查玉米叶片受黏虫危害程度及幼虫存活数，记录叶片被害级别并计算被害级别平均值，判定玉米心叶期对黏虫的抗性水平。危害程度分级标准及抗性评价标准参照农业部953号公告-10.1-2007。

棉铃虫：在吐丝期接虫，接虫方法及接虫次数同亚洲玉米螟。最后一次接虫14 d后调查雌穗被害率、幼虫存活数、雌穗被害长度，确定雌穗被害级别并计算平均值，判定玉米对棉铃虫的抗性水平。雌穗被害级别分级标准及抗性评价标准参照农业部953号公告-10.1-2007。

采用随机区组设计，3个处理，每个处理3次重复，小区面积为30 m2(5 m×6 m)，行距60 cm，株距25 cm，小区间设2 m间隔，以防害虫在不同小区之间扩散。除全生育期不喷施杀虫剂外，按常规方式播种及管理。

1.3 收获期对鳞翅目害虫的抗性鉴定

采用随机区组设计，3个处理，每个处理3次重复，小区面积为150 m2(5 m×30 m)，行距60 cm，株距25 cm，不进行人工接虫。除全生育期不喷施杀虫剂外，按常规方式播种及管理，调查自然条件下玉米对鳞翅目害虫抗性。

收获前，每小区对角线5点取样，每点取相邻4行的20株玉米，进行剖秆调查，记录植株受害率、雌穗及茎秆蛀孔数、活虫数。鳞翅目害虫控制效果计算公式如下：

其中，E为控制效果；D为当地对照品种玉米受害植株数或虫数；T为转基因抗虫玉米受害植株数或虫数。

1.4 草甘膦耐受性鉴定

供试除草剂：41%草甘膦异丙胺盐(glyphosate-isopropylammonium)水剂，美国孟山都公司生产，商品名农达。在玉米植株生长至6叶期喷施除草剂。采用随机区组设计，设8个处理，每个处理重复3次，共24个小区，小区面积4 m×6 m，每小区之间设1 m间隔。处理如下：(1)郑单958不喷施草甘膦；(2)郑单958喷施推荐剂量中剂量草甘膦(923 g·hm-2)；(3)郑单958喷施2倍推荐剂量中剂量草甘膦(1846 g·hm-2)；(4)双抗12-5-21不喷施草甘膦；(5)双抗12-5-21喷施推荐剂量中剂量草甘膦(923 g·hm-2)；(6)双抗12-5-21喷施2倍推荐剂量中剂量草甘膦(1846 g·hm-2)；(7)双抗12-5-21喷施4倍推荐剂量中剂量草甘膦(3692 g·hm-2)；(8)双抗12-5-21喷施6倍推荐剂量中剂量草甘膦(5538 g·hm-2)。

调查方法：参照农业部953号公告-11.1-2007，分别在用药后1、2、4周调查成苗率、药害症状(选取药害症状最轻的5株)，药害症状分级按GB/T 17980.42-2000执行，除草剂受害率计算公式如下：

其中，X为受害率；N为同级受害株数；S为级别数；T为总株数；M为最高级别。

2 结果与分析

2.1 双抗12-5-21对鳞翅目害虫的田间抗性

不同玉米品种对亚洲玉米螟田间抗性鉴定结果见表1。6叶期，感虫品种综31受害平均级值为8.49，虫害级别达到7级，为感虫水平；郑单958受害平均级值为5.52，虫害级别达到5级，表现为中抗亚洲玉米螟；而双抗12-5-21受害平均级值为1.12，虫害级别为1级，达高抗水平。花丝期，感虫品种综31受害平均级值为7.13，为感虫水平；郑单958受害平均级值为5.76，表现为感虫水平；而双抗12-5-21的受害平均级值为1.07，达高抗水平。方差分析结果表明，双抗12-5-21的受害平均级值显著低于当地对照。

不同玉米品种对黏虫田间抗性鉴定结果见表2。6叶期，感虫品种综31的受害平均级值为6.14，为感虫水平；郑单958受害平均级值为4.32，表现为中抗黏虫；而双抗12-5-21的受害平均级值为1.32，达高抗水平。方差分析结果表明，双抗12-5-21的受害平均级值显著低于当地对照。

不同玉米品种对棉铃虫田间抗性鉴定结果见表2。花丝期，感虫品种综31的受害平均级值为5.66，为感虫水平；郑单958受害平均级值为3.51，表现为中抗；而双抗12-5-21的受害平均级值为0.02，达高抗水平。方差分析结果表明，双抗12-5-21的受害平均级值显著低于当地对照。

从田间人工接虫鉴定结果看，双抗12-5-21对玉米田3种常见的鳞翅目害虫亚洲玉米螟、黏虫、棉铃虫的抗性均达到高抗水平，可以有效减轻鳞翅目害虫的危害。

表1 双抗12-5-21对亚洲玉米螟的田间抗性

表2 双抗12-5-21对黏虫、棉铃虫的田间抗性

2.2 双抗12-5-21收获期对鳞翅目害虫的抗性

由表3看出，双抗12-5-21受害株率为3.00%，而郑单958和综31受害株率分别为32.67%、68.33%；双抗12-5-21茎秆及雌穗蛀孔数为3.33，而当地对照和感虫品种分别为69.67和177.67；双抗12-5-21雌穗及茎秆虽然有少量蛀孔，但活虫数为0.00，而郑单958和综31活虫数分别为45.00和155.00头。方差分析结果表明，双抗12-5-21受害株率、蛀孔数、活虫数均远远低于当地对照郑单958和感虫品种综31，与二者之间差异显著。由于双抗12-5-21植株上未调查到害虫，根据虫数计算，双抗12-5-21对害虫的控制效果为100.00%；根据受害植株数计算，相比郑单958，双抗12-5-21的控制效果为90.82%。以上结果表明，自然条件下，双抗12-5-21对鳞翅目害虫抗性效果显著。

表3 双抗12-5-21收获期对鳞翅目害虫的抗性

2.3 双抗12-5-21对除草剂草甘膦的耐受性

由表4看出，处理1周后，郑单958不喷施草甘膦处理及双抗12-5-21各处理平均成苗率均为100.00%，郑单958喷施中剂量及中剂量2倍量草甘膦成苗率为0.00，受害率为100.00%，玉米苗全部死亡；双抗12-5-21中剂量草甘膦受害率为0.00，喷施2倍中剂量、4倍中剂量草甘膦受害率均为2.67%，喷施6倍中剂量草甘膦受害率为36.00%。统计分析表明，双抗12-5-21各处理受害率显著低于郑单958喷施草甘膦的2个处理，喷施6倍中剂量草甘膦受害率显著高于中剂量、2倍中剂量、4倍中剂量草甘膦的受害率。随着喷药浓度的增加，双抗12-5-21株高略有降低，但双抗12-5-21各处理之间株高差异不显著。

由表5看出，处理2周后，双抗12-5-21喷施中剂量、2倍中剂量、4倍中剂量草甘膦处理受害率为0.00；喷施6倍中剂量草甘膦处理的受害率明显降低，为8.00%，且均为在喷药初期叶部产生药害，新生叶片生长正常，但玉米株高显著低于双抗12-5-21其他处理；双抗12-5-21各处理受害率均显著低于郑单958。

药后4周，6倍中剂量草甘膦处理的抗12-5-21生长完全恢复正常，株高与该品种其他处理差异不显著，其他各处理表现与药后2周完全一致。

在大田使用除草剂时，一般喷施推荐剂量中剂量的除草剂，从本实验调查结果看，双抗12-5-21对目标除草剂草甘膦具有显著的耐受性，可以耐受4倍中剂量的草甘膦，喷施6倍中剂量草甘膦4周后，玉米生长完全恢复正常，株高与双抗12-5-21其他处理差异不显著。

表4 双抗12-5-21对草甘膦的耐受性(1周后)

表5 双抗12-5-21对草甘膦的耐受性(2、4周后)

3 讨论

将外源抗虫基因导入玉米，使之在玉米植株内持续表达抗虫蛋白，可以有效控制靶标害虫的发生(Burknessetal.，2001； Chilcuttetal.，2007；Horner & Dively，2003； Lynchetal.，1999)。美国于1996年开始商业化种植转基因玉米，转基因抗虫玉米的应用有效控制了玉米虫害的发生，经济、社会、生态效益明显(James，2015)。

转基因作物的环境安全性评价一般包括3个方面:一是外源基因功能评价，如抗虫性、除草剂耐受性、抗逆能力评价等(孙红炜等，2018； 王江等，2016);二是生存竞争能力评价，主要是转基因作物可能带来的“杂草化”风险，主要包括转基因作物本身的“杂草化”或者转基因作物抗除草剂基因漂移到杂草上，导致杂草抗性的产生(姜伟丽等，2018； 马小燕等，2013);三是对农田生物多样性影响评价，包括作物遗传多样性、农田节肢动物多样性、对靶标和非靶标害虫影响、土壤微生物多样性影响等(高欣欣等，2018； 洪鑫等，2020； 尹俊琦等，2017)。其中，第一方面是最重要也是最基本的一个指标，决定了转基因作物有无进行后续研究并推广应用的价值。

从全国大部分玉米种植区来看，亚洲玉米螟一代幼虫6月份在心叶内取食，8月上、中旬夏玉米穗期，第3代幼虫在玉米打苞后钻入苞内，抽雄后即向下转移，蛀入幼穗及茎内为害。黏虫是我国著名的迁飞性、暴食性及杂食性害虫，1、2龄幼虫仅啃食叶肉成天窗， 3龄以后沿叶缘蚕食成缺刻，危害严重时吃光大部叶片，只残留很短的中脉,心叶期及喇叭口期Bt蛋白表达量高低是决定对黏虫抗性的关键。棉铃虫喜温暖高湿，有强烈的趋嫩性，夏玉米抽雄未开花盛期，为棉铃虫产卵盛期，虫卵80%左右落在夏玉米抽出但未开花的幼嫩雄穗上，幼虫孵化后集中在幼嫩雌穗顶端花丝上取食。因此，根据不同鳞翅目害虫为害关键期，选择6～8叶期、花丝期进行亚洲玉米螟抗性鉴定，4～6叶期对黏虫、花丝期对棉铃虫进行抗性鉴定，可以更为客观地反映出转基因玉米对鳞翅目害虫的抗性。

田间抗性鉴定被认为是最直接、最可靠和最终的玉米抗虫性鉴定评价标准(何康来等，2000)。本试验中，在亚洲玉米螟、黏虫严重危害的心叶期进行的人工接虫抗性试验，双抗12-5-21对亚洲玉米螟和黏虫的抗性均达到高抗水平；在花丝期，双抗12-5-21对亚洲玉米螟和棉铃虫的抗性同样达高抗水平。王江等(2016)对双抗12-5对亚洲玉米螟的抗性研究表明，食叶级别平均值为1级，抗性类型为高抗，雌穗被害级别平均值为1.0，抗性类型为高抗，与本研究一致。常雪等(2013)研究了6个转cry1Ab/cry2Aj基因玉米品系对亚洲玉米螟抗虫性，春播和夏播田各转基因玉米品系叶片、茎秆、雌穗基本没有被害，食叶级别为1.0～1.5。本试验中为夏播玉米，心叶期平均食叶级别为1.12，同样叶片花丝、雌穗基本无被害症状。本试验中双抗12-5-21抗虫效果略优于常雪等(2013)所研究的品系，原因可能是本试验中所用品系是从多个品系中筛选出的最佳品系，而且试验玉米为杂交种，本身抗性较一般自交系玉米要强，另外可能与接虫量、接虫时气候条件，甚至试虫来源有关。

李桂玲和李欢庆(2007)的研究显示，叶片虫孔级别与茎秆隧道长度及茎秆虫孔数各自之间并无线性相关，茎秆隧道长度和茎秆虫孔数之间有极显著的相关关系。因此，茎秆及穗的虫孔数或隧道长度均可作为田间抗虫鉴定的指标。本试验选取茎秆及穗的蛀孔数进行调查，结果显示，转基因玉米受害率极低，仅为3.00%，且危害症状极轻微，茎秆及雌穗仅有3.33个蛀孔，未发现活虫，这与常雪等(2013)、王江等(2016)的研究基本一致。

草甘膦是一种非选择性除草剂，具有广谱灭生性，同时具有内吸性，药剂会从叶部传导到根部，杀死多年生杂草；此外，草甘膦无残留，在土壤中分解速度快，不会对下茬作物产生药害，因此应用广泛。但是，由于草甘膦的非选择性，在喷洒时，易伤害到作物本身，影响作物生长。将耐除草剂基因G10evo导入植株体内并表达，使植物具有对草甘膦的耐受性，可以有效避免草甘膦对自身的伤害。王江等(2016)研究了双抗12-5喷施推荐剂量及2倍推荐剂量草甘膦后的生长情况，结果4周内玉米生长正常，受害率为0.00。本研究设置了推荐剂量中剂量及2、4、6倍中剂量，结果表明，喷施4倍以内中剂量草甘膦2周后，双抗12-5-21完全无受害症状，喷施6倍中剂量2周后，植株受害率显著降低，新生玉米叶片正常，4周后植株生长完全恢复正常。

2014年，农业部发布了转基因生物新品种培育重大专项成果认定标准(试行)，明确规定：参照NY/T 1248.5-2006《玉米抗亚洲玉米螟鉴定技术规范》，转基因抗虫玉米对亚洲玉米螟的抗虫效果要达到高抗；转基因耐草甘膦玉米对草甘膦的耐受性要达到推荐剂量的5倍以上。本试验中，田间抗虫性鉴定结合收获期剖秆调查结果表明，在各相应时期，转基因抗虫玉米双抗12-5-21均显示了对亚洲玉米螟、黏虫、棉铃虫显著的抗虫效果，达到了高抗水平，同时对目标除草剂草甘膦具有显著耐受性，可以耐受4倍中剂量目标除草剂，喷施6倍中剂量目标除草剂4周后玉米生长完全恢复正常，具有进一步开发推广的潜力。