多噬香鞘氨醇单胞菌降解陕西神府褐煤的工艺条件及产物研究*

杨 杰 刘向荣，2 徐云龙

(1.西安科技大学化学与化工学院，710054 西安；2.自然资源部煤炭勘察与综合利用重点实验室，710021 西安)

0 引 言

煤的微生物降解是指煤在微生物作用下，大分子结构降解成小分子的过程。整个降解过程条件温和，设备简单，无污染，是煤炭洁净利用的有效途径之一[1-4]。降解产生的液相产物，包含小相对分子质量的脂肪族和芳香族化合物等，可进一步加工提取腐殖质材料、土壤调节剂、化学原料和液体燃料等[5]。20世纪80年代开始，国内外学者就对煤的微生物降解进行了广泛的研究。BASARGAN et al[6]研究了6种真菌对厄尔比斯坦褐煤和巴札利褐煤的降解效果，发现云芝是降解厄尔比斯坦褐煤的优势菌，研究表明菌种与煤种具有匹配性。HAIDER et al[7]对真菌MW1降解塔尔褐煤进行了研究，发现煤浆浓度、降解时间和葡萄糖含量对降解率的影响较大。徐敬尧等[8]研究了球红假单胞菌降解义马褐煤的工艺条件，各因素对降解率的影响由大到小依次为：煤样粒度、煤浆浓度、降解时间、菌液用量。李俊旺等[9-10]利用多种方法对褐煤进行了预处理，结果发现，硝酸预处理的效果最好，硝酸可以破坏褐煤的部分芳环结构，并对褐煤表面的官能团进行氧化，提高了含氧量，增加了微生物与煤表面的亲和性，促进了褐煤的微生物降解。由此可见，影响煤微生物降解率的主要因素为煤本身的性质，而各地的煤种差别较大，因此，微生物降解煤过程中，对煤的预处理、煤样粒度和菌煤比例等工艺条件的探讨很必要。

本实验利用多噬香鞘氨醇单胞菌对陕西神府褐煤进行降解实验，通过单因素和正交实验确定了多噬香鞘氨醇单胞菌降解陕西神府褐煤的最佳工艺条件。对降解的固相产物和液相产物的组成进行分析，研究了降解前后煤结构的变化，为进一步研究煤的微生物降解机理提供参考。

1 实验部分

1.1 煤样的制备

实验煤样采自陕西神府，经过破碎、粉磨、筛分，制得粒径分别为：小于0.074 mm，0.074 mm～0.125 mm，0.125 mm～0.250 mm，0.250 mm～0.500 mm和大于0.500 mm五种粒度原煤煤样。为提高降解率，不同粒径的原煤分别经过4 mol/L，6 mol/L，8 mol/L和10 mol/L的硝酸氧化48 h后(煤与硝酸的质量比为1∶2.5)，用蒸馏水洗涤至中性，烘干得到氧化煤样备用。粒径为0.074 mm～0.125 mm的原煤和8 mol/L的硝酸氧化煤及降解后的固相产物(剩煤)的工业分析和元素分析见表1。由表1可以看出，原煤经硝酸氧化后，灰分减少，碳元素、氢元素和硫元素质量分数降低，氧元素质量分数由23.96%增加到36.15%，氮元素质量分数由2.68%增加到5.08%；氧化煤经细菌作用后，碳元素、氧元素和氢元素质量分数有不同程度的降低，这表明煤中部分化学键断裂，小分子物质溶解到了液相产物中。

表1 煤样的工业分析和元素分析

1.2 菌种的活化

实验所用的多噬香鞘氨醇单胞菌(Sphingomonaspolyaromaticivorans)购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，编号为CICC 10894，可降解2环～4环的环芳香烃和菲。采用打管活化法对细菌进行活化。首先用75%的酒精棉将冻干管表面进行消毒处理，用镊子夹住管的中间位置，将管顶端在酒精灯外焰上加热45 s，立刻滴2滴～3滴无菌水于加热部位，使其破裂。随后用镊子轻敲使其破裂，用灭菌的吸管吸取0.5 mL无菌水溶解菌。然后，将接种环在酒精灯上高温灭菌后浸入到菌液中在固体培养基上划线，得到的斜面静置培养。最后，取斜面活化的菌种接种于100 mL的液体培养基中，在30 ℃，160 r/min的恒温振荡培养箱中扩大培养，菌种经过3代活化培养后，用于煤降解实验[11]。

1.3 培养基的配制

实验所用的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，具体组成为：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水1 L，pH值为7.0。将配制好的培养基置于高压灭菌锅120 ℃，0.1 MPa灭菌15 min备用。

1.4 煤微生物降解率的计算

煤微生物降解实验结束后，通过离心分离液相产物和固相产物(剩煤)，固相产物(剩煤)经过洗涤、干燥用于计算降解率。通常利用式(1)计算降解率η[12]。

η=(m0-m)/m0×100%

(1)

式中：m0为原煤/氧化煤样的初始质量，g；m为降解实验结束后固相产物(剩煤)的质量，g。

1.5 单因素实验

将(0.500 0±0.000 5)g的神府氧化煤样置于150 mL的锥形瓶中，加入50 mL培养基，然后高压灭菌15 min，待培养基冷却到常温时，再加入5 mL细菌菌液，随后将锥形瓶放入160 r/min的恒温振荡培养箱中培养一定时间。相同的培养条件下，分别改变降解时间(1 d，2 d，3 d，4 d，5 d，6 d，7 d，8 d，9 d，10 d，11 d，12 d，13 d，14 d，15 d)、硝酸浓度(0 mol/L，4 mol/L，6 mol/L，8 mol/L，10 mol/L)、培养温度(25 ℃，30 ℃，35 ℃，40 ℃)、煤样粒度(<0.074 mm，0.074 mm～0.125 mm，0.125 mm～0.250 mm，0.250 mm～0.500 mm，>0.500 mm)和降解方式(摇床培养、静置培养)，研究各因素对褐煤降解效果的影响。每组实验设置三个平行实验，培养结束后，离心分离液相产物和固相产物(剩煤)，利用式(1)计算平均降解率。

1.6 正交实验

在单因素实验的基础上，对煤样粒度(A)、硝酸浓度(B)、菌液量(C)和降解时间(D)采用四因素三水平正交实验。正交实验表头设计采用L9(34)。在本正交实验中不考虑各因素之间的交互影响。正交实验见表2。

表2 正交实验因素及水平

1.7 降解产物分析

对陕西神府煤的原煤、氧化煤和微生物作用后的固相产物(剩煤)进行扫描电镜分析。煤样喷金60 s，电压为5 kV，放大倍数为10 000倍。利用Thermo Scientific型傅立叶变换红外光谱仪(美国，赛默飞世尔科技有限公司)，采用定量KBr压片法，在4 000 cm-1～400 cm-1波长范围内，对原煤、氧化煤、固相产物(剩煤)、液相产物进行红外光谱扫描。煤的微生物降解实验结束后，将液相产物收集起来，通过直径为0.22 μm的除菌过滤器除掉残留菌丝体，以培养的菌液为参比进行实验，利用TU-1900型双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)检测其在波长200 nm～650 nm范围内的吸光度以推测液相产物的组成。将除菌过滤器过滤后的液相产物依次用石油醚、正己烷、甲苯、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮和甲醇分级萃取，旋蒸萃取产物除去水分，然后将处理好的产物分别用各对应的有机物稀释后，利用安捷伦7890A/5975C型气相色谱-质谱联用仪(美国，安捷伦科技公司)进行分析，流动相为甲醇，气氛为氦气。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 降解时间对降解率的影响

多噬香鞘氨醇单胞菌对神府褐煤的降解率随时间的变化如图1所示。由图1可以看出，第0天～第1天是菌种的快速繁殖时期，从第1天开始到第5天，多噬香鞘氨醇单胞菌对神府煤的降解率随着菌种的大量的繁殖而快速上升。在第5天～第8天，降解率保持平稳，略有下降，推测这是由于菌种将前期从煤中释放的部分有机物吸收用于自身生长。由于菌种的活性增强，在第8天～第9天降解率又出现了快速增长，在第9天～第12天出现缓慢上升的趋势，在第12天～第13天增长更为迅速。而在第13天～第15天降解率基本不变，降解率约为65%。因此，最佳的降解时间为13 d。

图1 降解时间对降解率的影响

2.1.2 硝酸浓度对降解率的影响

多噬香鞘氨醇单胞菌对不同浓度硝酸预处理煤样降解率的影响如图2所示。由图2可以看出，随着硝酸浓度的增大，煤样氧化程度增加，其降解率也逐渐增大。多噬香鞘氨醇单胞菌对原煤的降解率仅为12.25%，而对10 mol/L硝酸氧化煤的降解率最高，达到75.86%。由此可见，煤样氧化程度是影响微生物降解煤效果的重要因素之一。硝酸浓度越高，其氧化性越强，对煤样的破坏程度越大，同时除去了煤中的一些矿物质，提高了煤的纯度，煤结构更为疏松，使得降解率大幅度提高。

图2 硝酸浓度对降解率的影响

2.1.3 培养温度对降解率的影响

多噬香鞘氨醇单胞菌在不同温度下对神府煤的降解率如图3所示。由图3可以看出，降解率随着温度升高呈现出先升高后降低的趋势，多噬香鞘氨醇单胞菌在35 ℃时对神府煤的降解率最高(66.28%)。由此可见，多噬香鞘氨醇单胞菌在25 ℃条件下生长较为缓慢，菌种活性低，分泌物量小，使得降解效果不佳。当温度升至30 ℃，降解率明显增加。而在35 ℃时，多噬香鞘氨醇单胞菌处于最适生长温度，在其最适生长温度下，细菌快速生长繁殖，产生大量分泌物，促进了煤的微生物降解，降解率达到最大值。温度升至40 ℃时，较高的温度导致蛋白质变性，细菌分泌物活性降低，降解率减小。

图3 培养温度对降解率的影响

2.1.4 煤样粒度对降解率的影响

多噬香鞘氨醇单胞菌对不同粒径神府煤的降解率如图4所示。由图4可以看出，随着煤样粒度增大，降解率逐渐减小。当煤粒径为小于0.074 mm时，多噬香鞘氨醇单胞菌对神府煤的降解率为75.05%。当煤样粒度大于0.500 mm时降解率仅为49.02%。煤样粒径越小，煤的微生物降解效果越好，这是因为在相同的条件下，粒径越小，煤样的比表面积越大，更有利于煤样与微生物的分泌物相互接触，从而提升了降解效果[13]。

图4 煤样粒度对降解率的影响

2.1.5 降解方式对降解率的影响

多噬香鞘氨醇单胞菌降解神府煤在摇床培养与静置培养方式下的降解率分别为65.91%和45.25%，摇床培养条件下的降解率明显高于静置培养条件下的降解率。多噬香鞘氨醇单胞菌为好氧细菌，摇床培养能够增加培养基的溶氧率，提高细菌活性，促进煤的微生物降解，并且摇床培养也能够使煤样与微生物充分接触[14-15]。因此，摇床培养降解率高于静置培养降解率。

2.2 正交实验结果

多噬香鞘氨醇单胞菌降解神府煤的正交实验结果见表3。由表3可知，极差R的计算表明最佳工艺条件为A3B3C3D1，即0.074 mm～0.125 mm的煤样粒度、10 mol/L硝酸氧化煤样、8 mL菌液量、14天降解时间、35 ℃的培养温度以及摇床培养方式，此时最大降解率为78.59%。各因素对降解率影响由大到小顺序依次为：B，D，C，A。

表3 多噬香鞘氨醇单胞菌对神府煤的降解率实验结果分析

多噬香鞘氨醇单胞菌降解神府煤的实验结果方差分析如表4所示。查F分布表，F0.05(2,2)=19.0，

表4 多噬香鞘氨醇单胞菌降解神府煤的正交实验数据方差分析

F0.01(2,2)=99.0，F0.1(2,2)=9.0。由表4可知，在给定可信度90%的情况下，硝酸浓度对煤的微生物降解有非常显著的影响，与极差分析的结果一致。

2.3 扫描电镜分析

对神府煤的原煤、氧化煤和微生物作用后的固相产物(剩煤)进行扫描电镜分析，结果见图5。由图5可以看出，硝酸氧化和多噬香鞘氨醇单胞菌的作用均能改变神府煤的表面形态。神府煤未处理时呈块状、粒状或片状；经硝酸处理后，片状结构增多，煤样表面变得更加光滑和松散；经微生物处理后，煤样表面出现较多的沟壑，表明微生物能够有效地降解煤。

图5 煤样的扫描电镜照片

2.4 N2吸附分析

对原煤、氧化煤和固相产物(剩煤)进行低温氮气吸附-脱附。通过BET比表面积法和Langmuir比表面积法，计算的各煤样的比表面积如表5所示。由表5可知，通过BET法计算得到的结果显示神府煤经硝酸氧化后比表面积由1.191 3 cm2/g增加到5.603 1 cm2/g，是原煤的4.7倍。通过Langmuir法计算原煤经硝酸氧化后表面积增加了4.8倍。煤经多噬香鞘氨醇单胞菌作用后得到的固相产物(剩煤)的比表面积明显下降，这说明微生物作用能够降解煤的部分组成，使煤的比表面积发生变化。

表5 神府原煤和氧化煤及固相产物(剩煤)的累积吸附表面积

原煤、氧化煤和固相产物(剩煤)的孔容与相对压强的关系如图6所示。由图6a和图6c可以看出，原煤和固相产物(剩煤)的吸附-脱附曲线较为接近，这说明煤中主要含有一端封闭的不透气性孔。由图6b可以看出，氧化煤的吸脱附曲线产生了明显的滞后环且有拐点，推测其含有开放性透气性孔，包括两端开口圆筒形孔及四边开口的平行板孔[16-17]。

图6 煤样的N2吸附-脱附等温线

煤的比孔面积-孔径分布如图7所示。由图7可知，神府煤的孔径主要分布在4 nm以下，硝酸处理后孔径明显增加，主要分布在2 nm～100 nm，这说明硝酸处理使原煤的孔结构变大，由中孔变为大孔。鞘氨醇单胞菌尺寸为(500～1 000)nm×(1 000～3 000)nm[18]，因此，细菌仅吸附在煤的表面，对煤产生降解作用。YIN et al[19]在研究微生物降解页岩中烃类物质时，同样发现页岩样品的孔径(2 nm～50 nm)小于细菌的平均直径1 000 nm，限制了微生物进入页岩孔隙。

图7 原煤和氧化煤及固相产物(剩煤)的比孔面积-孔径分布

2.5 原煤和氧化煤及固液相产物的红外光谱分析

神府原煤、氧化煤、降解后的固相产物(剩煤)和液相产物的红外光谱见图8。由图8可以看出，原煤、氧化煤、液相产物和固相产物(剩煤)大部分结构是相同的，只是在个别谱峰位置处存在差异。硝酸预处理使得神府氧化煤在1 717 cm-1，1 540 cm-1和1 335 cm-1处出现明显的吸收峰，分别为羧基、硝基和羟基的特征峰[20，6]，表明神府煤在一定程度上被氧化，产生了更多的含氧官能团，造成了元素分析中氧化煤的氮和氧含量升高。

图8 神府原煤和氧化煤及固相产物(剩煤)以及液相产物的红外光谱

氧化煤在3 618 cm-1处存在显著的伯胺吸收峰，而固相产物(剩煤)并无明显存在，表明多噬香鞘氨醇单胞菌对氧化煤的伯胺产生了降解作用[5]。液相产物和固相产物(剩煤)的红外光谱在3 162 cm-1附近处均有一个明显的羟基吸收峰。氧化煤和液相产物在2 915 cm-1附近处的吸收峰为环烷烃，而固相产物(剩煤)中并未出现，这说明多噬香鞘氨醇单胞菌能够将环烷烃从氧化煤中释放到液相产物中[21]。氧化煤在1 717 cm-1和1 613 cm-1处的吸收峰分别为羧基和羰基的特征峰，经过细菌作用后，固相产物(剩煤)中该特征峰强度明显减弱。

液相产物在1 653 cm-1处出现强的吸收峰，说明羰基物质被降解到了液相产物中，峰位置的偏移则是由于共轭效应的存在[5]。液相产物在1 397 cm-1为甲基的弯曲振动。在1 232 cm-1处吸收峰为酚氧结构中的C—O伸缩与O—H弯曲，说明其含有大量的酚类物质[22]。在1 056 cm-1处C—O—C的吸收峰表明液相产物中含有酯类物质[23]。500 cm-1～1 000 cm-1处的吸收峰为芳环侧链，说明液相产物中含有芳香类化合物。

2.6 液相产物的紫外光谱分析

多噬香鞘氨醇单胞菌降解神府煤液相产物的紫外光谱如图9所示。由图9可知，在200 nm～650 nm的波长范围内有3个吸收带，最大吸收峰分别在203 nm，236 nm 和296 nm处。在203 nm和296 nm处分别为E2带和B带，两个吸收带是由苯环上三个共轭双键的π—π*跃迁引起的，表明液相产物含有芳香族化合物。在236 nm处的K带则证明液相产物中含有不饱和酮、醛、酸或酯等[24]。液相产物红外光谱中的苯环侧链、羰基和酯类物质的特征峰均与紫外分析的结果相对应。

图9 液相产物的紫外光谱

2.7 GC-MS分析

多噬香鞘氨醇单胞菌降解神府煤的液相产物总离子流色谱见图10。a～g的萃取剂分别为石油醚、正己烷、甲苯、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯和甲醇。由图10可以看出，每个有机溶剂的萃取都有峰出现，这些峰对应物质的相对分子质量在97～418之间，说明煤的大分子结构被降解为小分子物质。a和b的谱峰较为相似，主要含有酯类和酰胺类物质。甲苯萃取物主要包含芳香族化合物、烯烃、苯酚和酯类化合物。二氯甲烷萃取物中主要有含氮化合物、烯烃、醇、酯和酰胺类化合物。丙酮萃取物中主要含有恶唑、亚胺、苯酚、呋喃、酯和酰胺类化合物。乙酸乙酯萃取物主要含有酰胺类物质。甲醇萃取物主要含有酮、烷烃、胺、酯和酰胺类化合物。因此，多噬香鞘氨醇单胞菌能够降解神府煤产生烃类、酯类、酚类和酰胺类物质。GC-MS检测到液相产物存在2-甲基环己醇、1-环戊基乙酮、2，6-二叔丁基苯酚和邻苯二甲酸二(7-甲基辛基)酯等化合物。同时，液相产物的红外光谱分别在3162 cm-1，1 613 cm-1，1 232 cm-1和1 056 cm-1处出现羟基、羰基、酚羟基和酯基特征峰，紫外光谱在203 nm和296 nm处出现了芳香族化合物的吸收峰，说明GC-MS结果与红外和紫外光谱的分析结果相一致。

图10 液相产物总离子流色谱

3 结 论

1)多噬香鞘氨醇单胞菌降解神府褐煤的最佳工艺条件为：煤样预处理采用10 mol/L硝酸氧化，煤样粒度0.074 mm～0.125 mm，菌液量8 mL/50 mL(培养基)，降解时间14天，培养温度35 ℃以及培养方式采用摇床培养，此时最大降解率为78.59%。

2)神府氧化煤经细菌作用后，煤的表面出现较多的沟壑。硝酸氧化神府褐煤可以增加原煤的孔径、比表面积和含氧官能团，如羟基和羧基，有利于微生物和煤相互作用。氧化煤经多噬香鞘氨醇单胞菌降解后，开放性透气性孔变为封闭的不透气性孔，且孔径和比表面积均下降。

3)红外光谱、紫外光谱和气质联用的分析表明，多噬香鞘氨醇单胞菌降解煤中的芳环侧链和伯胺等，产生烃类、酯类、酰胺类和芳香类化合物。