山西产酸枣仁HPLC-UV-ELSD特征图谱及7个化学成分的含量测定

杨馥源,魏 洁,王玉龙,杜晨晖,闫 艳*,秦雪梅#

(1山西大学中医药现代研究中心,太原 030006;2山西振东道地药材股份有限公司;3山西中医药大学中药与食品工程学院;*通讯作者,E-mail:yanyan520@sxu.edu.cn;#共同通讯作者,E-mail:qinxm@sxu.edu.cn)

酸枣仁为鼠李科枣属植物酸枣ZiziphusjujubaMill.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chou的干燥成熟种子,始载于《神农本草本经》[1],列为上品,是我国35种贵重中药材之一,具有养心补肝、宁心安神、敛汗、生津之功效[2]。酸枣主要分布在我国北部的山西、河北等省,野生资源丰富,具有明显的地域性。山西省自古以来就是酸枣仁的主产区之一,如《别录》[3]云:“酸枣生河东川泽”,古之河东即指今山西、河北等地。酸枣在山西省属于广泛分布具有明显优势的野生植物。本课题组[4-6]建立了山西产酸枣仁黄酮类和皂苷类成分的指纹图谱。郭宝林课题组[7]研究表明酸枣仁中主要的黄酮类成分斯皮诺素含量高的产区有山西临汾(包括大宁和吉县)。由此可见,前期本课题组[4-6]、郭宝林课题组[7]、杨守娟等[8]、Shen等[9]和李飞鹤等[10]研究多集中于黄酮和皂苷类成分的分析,忽视了酸枣仁中生物碱类成分的分析及3种不同类型成分的同时分析。生物碱是酸枣仁中含量较高的一类成分[11],以异喹啉类、吲哚类和环肽类为主[12],其中环肽类生物碱可以协同戊巴比妥有效延长小鼠的睡眠时间,并且具有改善学习记忆的作用[13,14]。黄酮类和皂苷类成分同样可以增加戊巴比妥诱导的睡眠时间[12],此外,皂苷类成分在神经系统、免疫系统、心脑血管系统等方面具有广泛的药理作用[15]。以上三类成分均是酸枣仁镇静催眠的主要活性成分。

因此,本研究拟选择山西酸枣优质产区临汾市大宁县及运城市闻喜县和晋中市榆次区3个地区的酸枣为研究对象。首先建立基于高效液相色谱-紫外-蒸发光检测(HPLC-UV-ELSD)方法的酸枣仁中生物碱、黄酮和皂苷3类成分的特征图谱,并对酸枣仁中乌药碱、木兰花碱、斯皮诺素、维采宁Ⅱ、6‴-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B进行含量测定。该研究将为山西产酸枣仁的道地性提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

主要仪器:Waters e 2695高效液相色谱仪,配自动进样器、四元梯度泵、柱温箱、UV检测器以及Empower色谱工作站(美国Waters公司);ELSD 6000蒸发光散射检测器(美国奥泰公司);CPA 225 D型十万分之一分析天平(德国Sartorius公司);Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司);紫外可见分光光度计(北京普析公司)。

对照品乌药碱(批号HC 225036298)、木兰花碱(批号HA 061308198)、斯皮诺素(批号20160314)、酸枣仁皂苷A(批号20160315)和6‴-阿魏酰斯皮诺素(批号20160313)均购于宝鸡市辰光生物科技有限公司;维采宁Ⅱ(批号wkq 19061803购于四川省维克奇生物科技有限公司,酸枣仁皂苷B(批号20170210)购于南京春秋生物工程有限公司,以上对照品经HPLC归一化法测定质量分数均大于98%。乙腈和甲酸为色谱纯,购于赛默飞世尔科技公司(中国),其他试剂均为分析纯。

本次实验所用酸枣仁样品均为2019年9月初于山西省临汾市大宁、晋中市榆次区和运城市闻喜县3个地区手工采摘酸枣ZiziphusjujubaMill.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chou的种子。每个产地采集3批样品,每批样品不少于2 kg(见表1)。参考实地考察河北赞皇基地的酸枣仁加工流程,首先将新鲜采摘的酸枣置于通风干燥处晾晒;其次,将果肉干瘪后的酸枣放入水中浸泡24 h,手工脱果肉;最后,果核烘干(40 ℃)7-8 h,砸碎后得到酸枣仁。按照2015年版《中华人民共和国药典》酸枣仁含量测定方法进行水分测定,水分含量均低于9.0%,符合药典标准。所有样品均保存于山西大学中医药现代研究中心阴冷库。

表1 山西不同产地采摘的酸枣样本信息

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液的制备 分别称取乌药碱、维采宁Ⅱ、6‴-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B对照品适量,精密称定,分别加70%甲醇水制成浓度为1 mg/ml的母液;分别称取木兰花碱和斯皮诺素适量,精密称定,分别加70%甲醇水制成2 mg/ml对照品母液。精密吸取各成分对照品母液,加70%甲醇水配制为含乌药碱80 μg/ml、木兰花碱320 μg/ml、维采宁Ⅱ 20 μg/ml、斯皮诺素200 μg/ml、6‴-阿魏酰斯皮诺素180 μg/ml、酸枣仁皂苷A 200 μg/ml和酸枣仁皂苷B 100 μg/ml的混合对照品工作溶液。精密量取上述混合对照品工作溶液适量,用70%甲醇水逐级稀释成7个浓度梯度的标准曲线工作溶液。

1.2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末(过四号筛)约0.2 g,精密称定,置索氏提取中,加石油醚(60-90 ℃)适量,加热回流4 h,弃去石油醚,药渣挥去溶剂,转移至锥形瓶中,加入70%乙醇水20 ml,加热回流2 h,滤过,滤渣用70%乙醇水5 ml洗涤,合并洗液与滤液,回收溶剂至干,残渣加甲醇溶解,转移至10 ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

1.2.3 色谱条件 色谱柱为Apollo C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为0.1%甲酸水(A)和乙腈(B),梯度洗脱(0-26 min,10%-20% B;26-30 min,20%-23% B;30-43 min,23%-26% B;43-45 min,26%-37% B;45-47 min,37% B;47-54 min,37%-39% B;54-63 min,39%-100% B),流速为1.0 ml/min;柱温25 ℃,进样量10 μl;紫外检测波长为227 nm和335 nm;ELSD参数:漂移管温度105 ℃,空气体积流量为2.5 L/min。所有待测色谱峰在此条件下分离度良好(见图1)。

1.乌药碱(coclaurine);2.木兰花碱(magnoflorine);3.维采宁Ⅱ(vicenin Ⅱ);4.斯皮诺素(spinosin);5.6‴-阿魏酰斯皮诺素(6‴-feruloylspinosin);6.酸枣仁皂苷A(jujuboside A);7.酸枣仁皂苷B(jujuboside B)

2 结果

2.1 特征图谱

2.1.1 方法学考察

2.1.1.1 精密度试验 取同一批酸枣仁样品(编号S1)粉末,按“1.2.2”项方法制备供试品溶液,按“1.2.3”项色谱条件连续进样6次,记录各共有峰的保留时间和峰面积。结果显示,HPLC-UV 227 nm和335 nm、HPLC-ELSD指纹谱图中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于0.04%,表明仪器精密度良好。

2.1.1.2 稳定性试验 取同一批酸枣仁样品(编号S1)粉末,按“1.2.2”项方法制备供试品溶液,分别于室温放置0,3,6,9,12,24 h后,按“1.2.3”项色谱条件进样分析,记录各共有峰的保留时间和峰面积。结果显示,HPLC-UV 227 nm和335 nm、HPLC-ELSD特征谱图中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于0.27%,表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定性良好。

2.1.1.3 重复性试验 取同一批酸枣仁样品(编号S1)粉末,按“1.2.2”项方法平行制备6份供试品溶液,按“1.2.3”项色谱条件进样测定,记录各共有峰的保留时间和峰面积。结果显示,HPLC-UV 227 nm和335 nm、HPLC-ELSD特征谱图中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于0.26%,表明该提取方法的重复性良好。

2.1.2 山西产酸枣仁特征图谱的建立 取9批山西不同采收地点的酸枣仁样品,按“1.2.2”项方法制备供试品溶液,按“1.2.3”项色谱条件依次进样分析并将数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(8.0版)”软件,以S1号色谱图为参考,中位数法建立对照图谱,时间窗宽度设置0.1,选择多点校正进行匹配。在HPLC-UV 227 nm图谱中,9批酸枣仁样品相似度为1,以2号色谱峰(木兰花碱)为参照峰(S),计算1号色谱峰乌药碱的相对保留时间为0.84(见图2),在HPLC-UV 335 nm图谱中,9批酸枣仁黄酮类成分的相似度为0.979-0.991。结果表明各批次样品之间所含黄酮类成分相似度较高(见图3)。以4号峰(斯皮诺素)为参照峰(S),峰3(维采宁Ⅱ)、峰5(6‴-阿魏酰斯皮诺素)的相对保留时间分别为0.63和1.35。在HPLC-ELSD图谱中,9批酸枣仁样品皂苷类成分的相似度为0.995-0.999;以6号峰酸枣仁皂苷A峰作为参比峰(S),峰7(酸枣仁皂苷B)的相对保留时间为1.1(见图4)。

R.9批对照特征图谱;S1.批号D20190901;S2.批号D20190902;S3.生产批号D20190903;S4.批号W20190901;S5.批号W20190902;S6.批号W20190903;S7.生产批号Y20190901;S8.批号Y20190902;S9.批号Y20190903;1.乌药碱;2.木兰花碱(S峰)

3.维采宁Ⅱ;4.斯皮诺素(S峰);5.6‴-阿魏酰斯皮诺素

6.酸枣仁皂苷A(S峰);7.酸枣仁皂苷B

2.2 酸枣仁中7个化学成分的含量测定

2.2.1 线性关系考察 取“1.2.1”项7个浓度梯度的标准曲线工作溶液,按“1.2.3”项色谱条件依次进样分析。以指标成分的峰面积为纵坐标(Y),质量浓度为横坐标(X),进行线性回归,得回归方程、相关系数(r)和线性范围;按信噪比S/N=3计算7个指标成分的检测下限(low limit of detection,LLOD),按信噪比S/N=10计算其定量下限(low limit of quantification,LLOQ),7个指标成分在各自质量浓度范围内线性关系均良好(见表2)。

表2 七个指标成分的回归方程、相关系数、线性范围、检测下限和定量下限

2.2.2 精密度试验 精密吸取同一混合对照品工作溶液,按“1.2.3”项色谱条件,连续进样6次,记录7个指标成分的峰面积,并计算其峰面积的RSD值,结果显示,7个指标成分乌药碱、木兰花碱、维采宁Ⅱ、斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B的RSD分别为3.42%,0.66%,0.58%,0.56%,0.64%,0.40%和0.58%,表明仪器精密度良好。

2.2.3 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液(S1),按“1.2.3”项色谱条件,分别于0,2,4,8,12,24 h进样测定,计算乌药碱、木兰花碱、维采宁Ⅱ、斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的色谱峰面积的RSD分别为2.95%,1.60%,0.94%,1.55%,0.93%,0.66%和2.01%,结果表明,供试品溶液在室温条件下24 h内稳定。

2.2.4 重复性试验 取酸枣仁样品(S1)粉末6份,每份约0.2 g,精密称定,按“1.2.2”项方法制备供试品溶液,按“1.2.3”项色谱条件测定,计算7个成分的平均含量分别为:乌药碱0.221 mg/g,木兰花碱1.422 mg/g,维采宁Ⅱ0.074 mg/g,斯皮诺素0.697 mg/g,6‴-阿魏酰斯皮诺素0.503 mg/g,酸枣仁皂苷A 0.714 mg/g和酸枣仁皂苷B 0.384 mg/g,其RSD范围在1.95%-4.31%,表明提取方法的精密度良好。

2.2.5 加样回收试验 取已知含量的大宁产地酸枣仁样品(S1)粉末约0.1 g,共6份,精密称定分别加入与样品中各成分含量相对应100%的对照品混合溶液,按“1.2.2”项方法制备供试品溶液,按“1.2.3”项色谱条件进样,计算各成分回收率范围,并计算相应的RSD值。结果显示,乌药碱、木兰花碱、维采宁Ⅱ、斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的平均回收率范围均在90.55%-105.91%,RSD值均低于4.20%(见表3),表明提取方法的准确度良好。

表3 七种指标成分的加样回收率 (n=6)

2.2.6 样品测定 分别取不同批次的酸枣仁样品粉末各3份,分别按“1.2.2”项方法制备供试品溶液,按“1.2.3”项色谱条件进样10 μl,用外标两点法计算含量(以生药量计),乌药碱、木兰花碱、维采宁Ⅱ、斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的含量结果见表4。同时对不同产地同一成分的含量作单因素方差分析(ANOVA),发现不同产地酸枣仁7个成分含量有明显差异,差异有统计学意义(P<0.05),其中乌药碱、木兰花碱、斯皮诺素、酸枣仁皂苷A 4个成分在榆次产地显著高于大宁和闻喜产地,说明以单一成分评价酸枣仁优质产区具有一定的片面性,需要结合不同类别的多种成分同时评价。

表4 不同产地酸枣仁中7个成分的含量测定结果 (n=3,mg/g)

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

文献调研表明,酸枣仁中黄酮类和皂苷类成分多为同分异构体,如斯皮诺素和异斯皮诺素、当药黄素和异当药黄素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷A1、酸枣仁皂苷B和酸枣仁皂苷B1等[12]。为了保证待测成分的专属性,本研究对色谱条件进行了优化,分别考察了乙腈-0.1%甲酸水及乙腈-0.1%冰醋酸水系统,结果乙腈-0.1%甲酸水系统,各类成分分离度良好,峰型对称。分别对Agilent Zorbax SB-C18、Apollo C18和Phenomenex Luna C18色谱柱进行考察,结果表明,Apollo C18色谱柱对以上几对同分异构体的分离效果好,且耐用性强。

3.2 黄酮类成分的含量分析

斯皮诺素和酸枣仁皂苷A为2015年版《中华人民共和国药典》酸枣仁项下的含量测定指标。由测定结果可知,3个产地间酸枣仁中各组分含量差异较大,其中大宁和闻喜2个产地成分含量较为接近,榆次产地7个成分含量均高于其他地区。值得注意的是,《中华人民共和国药典》规定酸枣仁斯皮诺素含量应当大于0.08%,大宁县和闻喜县均达不到这一标准。对于酸枣仁中的黄酮类成分斯皮诺素而言,达不到《中华人民共和国药典》规定标准已是普遍现象。由此推测,不同产地样品间各组分的含量差异可能是产地和采收期两方面的因素导致的。因此,加强酸枣仁道地性研究,明确酸枣仁药材的道地区划,加强和规范酸枣仁饮片的生产规范化技术研究势在必行。

本实验在同一色谱条件下,建立了一种同时分析酸枣仁中3种不同类型成分的分析方法。建立的HPLC-UV-ELSD特征图谱共标定了7个共有峰,可用于初步鉴定酸枣仁的品种来源。酸枣仁药材根据产地不同,乌药碱、木兰花碱、维采宁Ⅱ、斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的含量存在显著的差异,其中晋中市榆次区产酸枣仁中乌药碱、木兰花碱、斯皮诺素、酸枣仁皂苷A成分含量显著高于其他两个地区。基于不同类型成分含量的酸枣仁质量评价方法更加科学、合理。该方法专属性强、准确,具备定性和定量双重作用,为山西酸枣仁产地的道地性研究提供实验依据。