鲁甸县青花椒中麻味素的提取工艺研究

王 锐，安 婷，杨红霞，熊汝琴

（昭通学院 化学化工学院，云南 昭通657000）

花椒（Zanthonxylum bungeanum Maxim）为芸香科、花椒属落叶灌木或小乔木[1]。花椒作为我国传统调味品，辛麻味是其主要特征风味，也是其品质评价的重要指标。研究人员对花椒果皮中的化学成分做了大量的研究，其化学成分主要为挥发油、生物碱、麻味素、木脂素、香豆素等[2]。此外，还含有少量的甾醇类、三萜类、黄酮甙类、芳香烃类等化合物[3]。花椒最有特色的成分是其麻味素，主要是一些酰胺类化合物。该化合物大多数为链状不饱和脂肪酰胺，其中以山椒素类为代表，具有强烈的刺激性，其它则为连有芳环的酰胺[4]。现代药理研究表明，酰胺类物质具有多种生物活性功能，如麻醉、镇痛、抑菌、杀虫、祛风、除湿等[5]。

花椒具有喜水肥、耐瘠薄、抗旱、耐寒等特性，适合大部分地区种植[6]，在我国有着悠久的栽培历史，种植面积广泛。云南省是我国重要的花椒种植基地之一，昭通市则是云南省花椒产量的第一大主产区，种植有青花椒（Zanthoxylum schinifolium Zucc）和红花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim）等品种。其中青花椒种植面积超过6.67 万公顷，约占全省的53%，主要分布于鲁甸县、永善县、彝良县、巧家县、大寨乡等乡镇[7]。鲁甸县因其独特的气候条件，青花椒产量高，且品质优良，其颗粒硕大，麻味纯正、浓郁，备受人们喜爱，青花椒已成为当地人民的经济支柱产业。

目前，国内外对青花椒麻味素的检测方法没有进行统一，缺乏对应的标准品。同时，在花椒麻味等级的评判方法和评判标准等方面的评价体系也不健全。人们在花椒麻味物质的成分分析和药理作用等方面做了一定研究[8]，但在花椒麻味素含量方面的研究较少，从而导致花椒产业发展缓慢。笔者通过对青花椒中麻味素的提取工艺研究为鲁甸花椒产业的发展和花椒品质的鉴定提供理论依据，进而为鲁甸青花椒建立一种科学、合理、有效的品质评价方法。

1 仪器及材料

1.1 仪器

RE-52AA 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SK5200LHC 超声波清洗仪（上海科导超声仪器有限公司）；YB-150 高速多功能粉碎机（永康市速峰工贸有限公司）；DHG-9023A 电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；CP214电子天平（上海奥豪斯有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水真空泵（天津华鑫仪器厂）等。

1.2 材料和试剂

青花椒于当年8月中旬采购自鲁甸县梭山乡。

氢氧化钠（广东省化学试剂工程技术研究开发中心）；邻苯二甲酸氢钾（天津市风船化学试剂科技有限公司）；甲醛（济南源茂化工有限公司）等试剂均为分析纯。

2 实验方法

麻味素是由含氮的酰胺类物质组成，但青花椒中的蛋白质、生物碱等物质也有含氮成分，采用乙醇作为提取溶剂可以减少杂质和干扰物质对实验结果的影响，故选用乙醇作为提取青花椒中麻味素的浸提溶剂[9]。在所得浸膏中滴加一定量体积分数50%硫酸溶液，可将浸膏中麻味素的氮转变为NH4+,该离子能用滴定法间接测出其含量，而干扰物质中的氮则与体积分数为50%硫酸反应生成N3+，N3+不对实验造成影响。由于所需测定的NH4+酸性太弱，不能用NaOH 溶液直接滴定，所以选用甲醛法间接测定青花椒中麻味素的提取率[10]。其化学方程式为:

4NH4++6HCHO=（CH2）6N4H++3H++6H2O

该法使含氮成分物质的酸性被加强，从而使其可采用NaOH 溶液进行滴定[11]。花椒麻味素和（CH2）6N4H+反应的化学计量系数比为1，故生成的（CH2）6N4H+量与花椒麻味素的量等同。

2.1 原料预处理

将新鲜、颗粒饱满的青花椒放于鼓风烘箱中，在65 ℃下进行干燥，去除籽粒后，置于粉碎机中进行粉碎，过60 目筛，密封保存备用。

2.2 单因素试验制备浸膏

以乙醇为提取剂，采用超声波辅助提取法[12-15]，考察在不同超声时间、料液比、乙醇体积分数条件下，制备青花椒麻味素浸膏。

2.2.1 不同超声辅助提取时间下制备浸膏

准确称取5 份5.0000 g 青花椒粉末，置于250 mL锥形瓶中，加入100 mL 体积分数95%的乙醇溶液，室温下浸泡10 min 后，分别超声（53kHz）浸提10、20、30、40、50 min，然后减压抽滤，将所得滤液真空浓缩得到浸膏，冷却至室温进行称量。

2.2.2 不同料液比下制备浸膏

准确称取5 份5.0000 g 青花椒粉末，置于250 mL锥形瓶中，分别按料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）加入体积分数95%的乙醇溶液，室温下浸泡10 min 后，超声（53kHz）浸提30 min，然后减压抽滤，将所得滤液真空浓缩得到浸膏，冷却至室温进行称量。

2.2.3 不同乙醇浓度下制备浸膏

准确称取5.0000 g 青花椒粉末5 份，置于250 mL 锥形瓶中，分别加入100 mL 体积分数55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶液，室温下浸泡10 min 后，超声（53kHz）浸提30 min，然后减压抽滤，将所得滤液真空浓缩得到浸膏，冷却至室温进行称量。

2.3 铵态氮的转化

准确称取“2.2”项中所得浸膏0.6000 g 置于125 mL 圆底烧瓶中，分别加入6.00 mL 一定体积分数的乙醇溶液和4.00 mL 体积分数50%的硫酸溶液，摇匀，溶解浸膏，待溶解完全后置于沸水浴中反应30 min，使脂肪酸酰胺充分地转化为铵态氮，再加入3.00 g 活性炭，沸水浴中脱色反应30 min，趁热过滤，滤液冷却加蒸馏水定容至100 mL，保存待用。

2.4 麻味素的测定

准确量取“2.3”项溶液10.00 mL 于100 mL锥形瓶，滴加2 滴甲基红指示剂，用0.65 mol/L，NaOH 溶液进行滴定消除多余的酸，使溶液颜色由红色变为黄色。然后加入体积分数18%甲醛溶液1.00 mL，并滴加2 滴酚酞指示剂，振荡摇匀让其反应5 min，再用已知准确浓度的NaOH 溶液进行滴定，溶液终点颜色由黄色变为橙红色，记录所消耗的NaOH 标准溶液体积，平行滴定3 次，求平均值，并代入以下公式，计算青花椒中麻味素的提取率。

式中，2.2696 为系统误差矫正系数；C 为NaOH 标准溶液的浓度（mol/L）；为3 次滴定消耗NaOH 标准溶液的平均体积（mL）；14.0067 为氮的相对分子质量；m1为花椒粉末质量（g）；m2为浸膏总质量（g）；m3为取用浸膏质量（g）。

2.5 正交实验设计

根据单因素试验的结果，以料液比（A）、超声时间（B）、乙醇体积分数（C）作为研究因素，设计正交实验因素及水平，如表1所示。

表1 正交实验因素及水平Tab 1 Factors and levels of orthogonal experiment

3.结果与分析

3.1 单因素实验

3.1.1 超声时间

在固定料液比1∶10（g/mL）、乙醇体积分数为95%的条件下，以不同超声时间进行单因素实验，并计算出不同超声时间下各组青花椒中麻味素的提取率，结果如图1所示。

图1 超声时间对青花椒中麻味素提取率的影响Fig.1 The effect of ultrasonic time on the extraction rate of numb-taste components in Zanthoxylum schinifolium Zucc

由图1 可知，超声时间在10 ～30 min 时，青花椒中麻味素的提取率随超声时间的延长而增加；超声30 min 时，麻味素的提取率达最大，为16.63%；之后随着超声时间的延长，麻味素提取率反而降低。产生这一现象的原因是由于超声时间短，麻味素从青花椒中浸提不完全；当超声30 min时，青花椒中的麻味素提取充分；再继续延长超声时间，提取物中的杂质增多，且浸出的麻味素也会因长时间超声，其结构受到破坏，从而导致青花椒中麻味素提取率降低，因此确定超声30 min为宜。

3.1.2 料液比

固定乙醇体积分数为95%、超声30 min，以不同料液比进行单因素实验，并计算出不同料液比下各组青花椒中麻味素的提取率，结果如图2所示。

图2 料液比对青花椒中麻味素提取率的影响Fig.2 The effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of numb-taste components in Zanthoxylum schinifolium Zucc

由图2 可知，当料液比为1∶10 ～1∶20（g/mL）时，麻味素的提取率逐渐升高；当料液比为1∶20（g/mL）时，青花椒麻味素的提取率最大，为13.43%；之后随着料液比的增加，青花椒麻味素的提取率降低。产生这一现象的原因是料液比较小时，青花椒中麻味素溶出不充分，增大料液比促进了青花椒中麻味素的溶出。料液比为1∶20（g/mL）时，青花椒中麻味素的溶出达到饱和，再继续增大料液比，会造成溶剂浪费，所以确定料液比1∶20（g/mL）为宜。

3.1.3 乙醇体积分数

固定料液比1∶20（g/mL）、超声30 min，以不同体积分数的乙醇溶液进行单因素平行实验，并计算出不同体积分数的乙醇溶液下各组青花椒中麻味素的提取率，结果如图3所示。

由图3 可知，乙醇体积分数在55%～75%时，青花椒中麻味素的提取率随乙醇体积分数的增大而升高；当乙醇体积分数增大至75%时，麻味素提取率最高，为17.72%；之后随着乙醇体积分数的增大，青花椒中麻味素的提取率逐渐降低。这是由于乙醇体积分数较小时，溶液极性较大，不利于青花椒中麻味素的提取；而乙醇体积分数较大时，溶液极性降低，青花椒中一些脂溶性成分溶出，抑制麻味素的提取，当乙醇体积分数增大至95%时，麻味素的提取率急剧降低为8.21%。根据“相似相溶”原理，确定乙醇体积分数75%为宜。

3.2 正交试验

根据“2.5”实验按L9（33）设计正交试验，试验结果如表2所示。

表2 正交实验结果与分析Tab 2 Results and analysis of orthogonal experiment

分析表2 实验数据可得，影响青花椒中麻味素提取的主次因素顺序为C＞B＞A；青花椒中麻味素的最佳提取工艺为A2B1C1，即料液比1∶20（g/mL）、超声20 min、乙醇体积分数65%，青花椒中麻味素的提取率最高。

3.3 验证实验

分别准确称取5 份5.0000 g 青花椒粉末，置于250 mL 锥形瓶中，按正交试验筛选出的最佳工艺条件进行提取，将提取液减压过滤，真空浓缩得到浸膏。根据“2.3”和“2.4”项进行测定和计算，结果如表3所示。

表3 验证实验结果Tab 3 Verification experiment results

由表3可知，在超声时间20 min、料液比1∶20（g/mL）、乙醇体积分数65%条件下，进行青花椒中麻味素提取验证实验，麻味素提取率分别为23.45%、23.10%、23.81%， 平均值为23.45%，RSD 值为0.29%。结果表明，由正交实验筛选的提取工艺条件是有效、可行的。

4 结果与讨论

采用超声波辅助提取青花椒中的麻味素，研究了超声时间、料液比、乙醇体积分数3 个因素对青花椒中麻味素提取的影响。由正交试验结果可知，影响青花椒中麻味素提取的主次因素顺序为乙醇体积分数＞超声时间＞料液比，最佳提取工艺为超声20 min、料液比1∶20（g/mL）、乙醇体积分数65%，青花椒中麻味素的提取率最高，为23.45%。

青花椒中的麻味素有着较高的药用价值，其检测方法较多，如高效液相色谱法、气质联用法等，这些仪器设备价格昂贵，所需实验环境要求较高，且缺乏相应的标准品，不易推广。采用超声波辅助提取，甲醛滴定法测定花椒中的麻味素，其操作简捷、高效，所需仪器、试剂成本低，在实际应用中更便于推广。本研究结果为昭通鲁甸县花椒的产业化开发提供了实验依据。