清肺抑火片的质量标准提升研究

田淋淋，高 嵩，刘 欣，李 双，张 斌，宋艳朋，徐 建

（1.吉林修正药业新药开发有限公司，吉林省中药标准化关键工程技术重点实验室，长春130103；2.修正药业集团股份有限公司，通化134000）

清肺抑火片处方由黄芩、栀子、黄柏、桔梗、大黄、知母、前胡、苦参、天花粉九味组成，具有清肺止嗽，降火生津的功效。用于治疗肺热咳嗽，痰延壅盛，口鼻生疮，牙根出血，牙齿疼痛，咽喉肿痛，小便赤黄，大便干燥等症状。质量标准收载于卫生部药品标准中药成方制剂第二册（WS3-B-0418-90）。现行标准较低，仅有片剂检查项，无法全面控制产品质量，故本文采用显微鉴别法、薄层色谱（TLC）法对处方中的大黄、桔梗、黄柏、苦参进行定性鉴别研究，采用高效液相色谱（HPLC）法对方中栀子中主要成分栀子苷进行含量测定研究，并进行方法学验证，完善和提高了清肺抑火片的质量标准，有效控制产品质量，保证产品疗效。

1 仪器与试药

1.1 仪器设备

戴安U3000高效液相色谱仪；MS205DU型电子天平（梅特勒-托利多公司）；SB25-12DT型超声波清洗器（有限公司）；薄层色谱摄影仪SLD-1（天津思利达色谱技术开发公司）；电子显微镜。

1.2 材料与试剂

清肺抑火片（批号：181101、181102、181103），均由修正药业集团股份有限公司提供；栀子苷对照品（批号：110749-201919）、黄柏对照药材（批号：121510-201606）、盐酸小檗碱对照品（批号：110713-201814）、苦参对照药材（批号：121019-201708）、苦参碱对照品（批号：110805-201709）；甲醇、正丁醇、甲苯、乙酸乙酯、冰醋酸、氨水、丙酮、三氯甲烷等均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 大黄、桔梗显微鉴别

取本品，置显微镜下观察：草酸钙簇晶大，直径60～140μm（大黄）。联结乳管直径14～25μm，含淡黄色颗粒状物（桔梗）。详见图1、图2。

图1 大黄显微鉴别图

图2 桔梗显微鉴别图

2.2 黄柏的薄层鉴别

取本品适量，置研钵中研细，称取1.0g置100ml锥形瓶中，加入三氯甲烷20ml、浓氨试液1ml，超声处理15min，滤过，滤液置蒸发皿中蒸干，残渣加三氯甲烷2ml使溶解，作为供试品溶液。另取黄柏对照药材1.0g，加甲醇20ml，超声处理15min，滤过，滤液置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。取按处方比例及制法制备的黄柏阴性样品，同法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法（中国药典2015年版四部通则0502）试验，吸取上述供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液、阴性对照溶液各2μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性无干扰。详见图3。

图3 黄柏薄层色谱图

2.3 苦参的薄层鉴别

取“2.2”项下供试品溶液，作为供试品溶液。取苦参对照药材1.0g，同法制成对照药材溶液。另取按处方比例及制法制备的苦参阴性样品，同法制成阴性对照溶液。再取苦参碱对照品，加乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015年版四部通则0502）试验，吸取上述供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液、阴性对照溶液各2μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-浓氨试液（2∶4∶3∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性无干扰。详见图4。

图4 苦参薄层色谱图

2.4 栀子苷的含量测定

2.4.1 检测波长的选择

取栀子苷对照品适量，用甲醇溶解，采用DAD检测器，于200～400nm波长下检视光谱图。栀子苷在240nm波长处出现最大吸收。故选择240nm作为栀子苷的检测波长。详见图5。

图5 栀子苷的紫外吸收图

2.4.2 色谱条件

色谱柱：welch Ulitmate C18柱（5μm，4.6mm×250mm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85）；检测波长为240nm。理论板数按栀子苷峰计算应不低于6000。

2.4.3 溶液的制备

2.4.3.1 对照品溶液的制备

取栀子苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每lml含60μg的溶液，即得。

2.4.3.2 供试品溶液的制备

取本品20片，置研钵中研细，取约0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，称定重量，超声处理30min，取出，放冷，再次称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4.3.3 栀子阴性样品溶液的制备

取按处方比例栀子的阴性对照样品，按“2.4.3.2”项下方法制备阴性样品溶液。

2.4.4 测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。

2.4.5 线性关系考察

取栀子苷对照品溶液，浓度分别为0.0154、0.0308、0.0617、0.123、0.3083mg/ml。精密吸取上述对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标（Y），以进样量为横坐标（X），绘制标准曲线，回归方程为Y=0.0044X+0.0017，r=0.9999。表明栀子苷在0.154～3.083μg范围内呈良好线性关系。

2.4.6 专属性试验

分别精密吸取“2.4.3”项下对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10μl，注入液相色谱仪，依法测定。结果阴性对照样品的色谱图中，在与栀子苷对照品吸收峰保留时间的相应位置上，无吸收峰出现，表明阴性对照无干扰，此方法专属性强。详见图6。

图6 栀子苷含量测定HPLC色谱图

2.4.7 精密度试验

取栀子苷对照品溶液，重复进样6次，每次10μl，结果栀子苷峰面积RSD=0.20%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.4.8 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、18、24h按“2.4.2”项下色谱条件测定，记录栀子苷峰面积，结果RSD=1.01%，表明供试品溶液在24min内稳定。

2.4.9 重复性试验

取同一批样品（批号：181101）适量，置研钵中研细，取约0.5g，精密称定，共6份，按“2.4.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.2”项下色谱条件测定栀子苷含量。结果栀子苷的平均含量为4.0049mg/g，RSD=0.39%（n=6），表明此方法重复性良好。

2.4.10 加样回收率试验

取已知含量的清肺抑火片（批号：181101，含量：4.0049mg/g），取约0.25g，精密称定，共6份，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入栀子苷对照品溶液（栀子苷对照品用50%甲醇制成浓度为0.0214mg/ml的溶液）50ml，“2.4.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.2”项下色谱条件测定，计算加样回收率。结果平均回收率为99.8%，RSD=0.43%（n=6），表明此方法准确可行。结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.4.11 样品含量测定

依法对3批清肺抑火片（批号：181101、181102、181103）进行含量测定，结果见表2.。

表2 3批样品含量测定结果

3 讨论

清肺抑火片现执行标准较低，为能更全面的控制产品质量，我们进行了较系统的质量标准研究，方中大黄和桔梗为粉末入药，故建立了显微鉴别项。建立的黄柏、苦参薄层鉴别方法，重现性好，专属性强。栀子是方中主要药味，栀子苷是其主要药效成分，故增加栀子苷含量鉴别项，方法简单易操作、专属性强，分离度高，重现性好，可有效控制产品质量。