侧柏叶对家兔心肌缺血-再灌注损伤的保护效应及其胆碱能抗炎作用*

李 丽 高 波 刘梅芳

(济宁医学院药学院，日照 276826)

冠心病严重威胁人类健康，心肌缺血-再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)是冠心病治疗过程中面临的一大挑战，而寻求抵抗MIRI的药物具有重要的临床应用价值。目前认为，MIRI的损伤机制与自由基损伤、钙超载和炎性损伤等有关[1]。

我们的前期研究表明，侧柏叶(Cacumen Biotae,CB)乙酸乙酯提取物具有抗氧化应激、抗炎[2]等功效，因此我们推测CB乙酸乙酯提取物对MIRI有治疗作用。本文以心率、收缩压、血清肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-a)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、乙酰胆碱(acetyl choline,ACH)以及心肌组织总一氧化氮合成酶(nitric oxide synthetase,NOS)为检测指标，探讨CB对家兔MIRI的保护效应及其相关机制。

1 材料与方法

1.1 动物

健康成年家兔32只，体重2～2.5kg，雌雄不限，由山东大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂

侧柏叶取自济宁医学院本草园，去枝干，留针尖叶。石油醚分析纯(批号：20130419)购自烟台三和化学试剂有限公司；乙酸乙酯(批号：20151214)购自上海山蒲化工有限公司；LDH(批号：20170516)试剂盒、CK(批号：20170511)试剂盒、IL-6(批号：20170518)试剂盒、TNF-α(批号：20170518)试剂盒、ACH(批号：20170517)试剂盒以及NOS(批号：20170511)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 侧柏叶乙酸乙酯萃取物制备

新鲜侧柏叶200g，清洗阴干后，用粉碎机磨成粗粉，并以1∶10的比例连续3次加水煎煮，每次1.5h，合并煎液并用抽滤装置过滤，并将滤液于60℃以下用旋转蒸发仪浓缩，然后用分液漏斗按照1∶1的比例，先用石油醚萃取分层后取水层，再用同等比例的乙酸乙酯萃取，最后用旋转蒸发仪浓缩为浸膏，得侧柏叶乙酸乙酯萃取物，并置于4℃冰箱备用，用蒸馏水将侧柏叶乙酸乙酯萃取物稀释为1×103g/L的混悬液灌胃。

1.4 家兔MIRI模型制备

家兔被麻醉、仰卧位固定、气管插管后，沿胸骨正中线右侧旁开1～2cm处切开皮肤，钝性分离皮下组织，暴露并剪断3～5根肋骨，暴露心脏，剪开心包膜，提起右心耳，将连有缝合线的无创小圆弯针从右冠状沟下方穿过，再用套有橡胶管的细铁钩勾住缝合线的两端，并缓慢拉入橡胶管，之后再将家兔的肌肉和皮缝合，并将橡胶管暴露在外。轻拉缝合线，收紧橡皮管，用止血钳同时钳住缝合线和橡胶管30min，以此造成冠状动脉的缺血，松开止血钳使心脏再灌注30min，以此制备家兔心肌缺血再灌注的模型。实验过程中，心电图Ⅱ导联显示ST段显著抬高或压低说明心肌缺血成功，放松缝合线后，心电图Ⅱ导联显示ST段或T波较前有回落，说明再灌注成功。

1.5 动物分组及指标测定

健康成年家兔32只随机被分为假手术组、模型对照组、侧柏叶乙酸乙酯提取物组以及侧柏叶迷走神经切断组，每组各8只。各组动物均按照图1所示的实验流程进行操作，心肌缺血30min再灌注30min后，颈总动脉取血、取心脏后，分别进行心肌切片TTC染色，再次确认造模是否成功；心肌总NOS含量测定(比色法)、血清CK、LDH含量测定(比色法)、血清TNF-α、IL-6含量测定(ELISA法)以及血清ACH含量测定(微板法)，以观察侧柏叶对家兔MIRI的保护效应及胆碱能抗炎通路在此过程中的作用。

注：TTC.氯化三苯基四氮唑

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 4组家兔动脉收缩压和心率变化比较

假手术组家兔手术前后收缩压和心率无明显变化(P>0.05)，除乙酸乙酯提取物组心肌缺血后收缩压下降无统计学意义外，其余各组家兔心肌缺血后收缩压均明显下降，心率减慢(P<0.05)，心肌缺血-再灌注后心率、收缩压进一步下降(P<0.05)。与模型对照组相比，侧柏叶乙酸乙酯提取物组心肌缺血-再灌注后心率和收缩压的下降率(缺血前-再灌注后30min/缺血前)明显降低(P<0.01)，但与侧柏叶乙酸乙酯提取物组相比，侧柏叶迷走神经切断组收缩压和心率的下降率明显升高(P<0.01)，如表1所示。

表1 4组家兔心肌缺血-再灌注前后心率及收缩压的变化

2.2 4组家兔血清心肌酶的含量比较

与假手术组相比，模型对照组、侧柏叶乙酸乙酯提取物组以及侧柏叶迷走神经切断组血清CK、LDH含量明显升高(P<0.01)，但与模型对照组相比，侧柏叶乙酸乙酯提取物组和侧柏叶迷走神经切断组明显降低(P<0.01)，而侧柏叶乙酸乙酯提取物组又明显低于侧柏叶迷走神经切断组(P<0.01)。见表2。

表2 4组家兔心率和收缩压变化率以及血清LDH和CK含量比较

2.3 4组家兔血清Ach、TNF-α、IL-6及心肌组织总NOS的含量

与假手术组相比，模型对照组、侧柏叶乙酸乙酯提取物组和侧柏叶迷走神经切断组血清Ach、TNF-α、IL-6含量明显升高(P<0.01)，心肌组织总NOS含量明显降低(P<0.01)。与模型对照组相比，侧柏叶乙酸乙酯提取物组血清TNF-α、IL-6含量则明显降低(P<0.01)，血清Ach和心肌组织总NOS含量明显升高(P<0.01)。而侧柏叶乙酸乙酯提取物组血清TNF-α、IL-6含量明显低于侧柏叶迷走神经切断组(P<0.01)，血清ACH以及心肌组织总NOS含量明显高于侧柏叶迷走神经切断组(P<0.01)。见表3。

表3 4组家兔血清Ach、TNF-α、IL-6水平和心肌组织NOS含量比较

3 讨论

目前，冠心病发病率和死亡率逐年上升，且发病年轻化趋势明显[3-4]。冠状动脉再通是治疗冠心病的主要方法，但冠状动脉再通后容易导致MIRI，所以寻求能对抗MIRI的药物具有重要意义。我们的研究表明，侧柏叶乙酸乙酯提取物能明显减小家兔MIRI心率和收缩压的降低率，显著减弱血清心肌酶CK和LDH的升高，提示侧柏叶对MIRI具有保护作用，这将对冠心病的治疗提供重要的参考依据。

在人类及哺乳动物，窦房结、右心房、右心室、房室结、左室后壁等均接受右冠状动脉的供血[5]，因此右冠状动脉供血不足可导致心率减慢和收缩压降低。缺血-再灌注后可使心肌细胞水肿、胞膜和线粒体的损伤进一步加剧[6]。这可能是导致心肌缺血-再灌注后心率与收缩压进一步降低的原因[7]。心肌内存在大量的心肌酶，在心肌细胞膜通透性增加或心肌缺血性坏死时，大量的心肌酶释放入血，引起血清中心肌酶升高，而血清心肌酶的升高程度在某种程度上与心肌细胞的损伤成正相关[8]。在本研究中，侧柏叶能明显降低家兔MIRI后血清CK和LDH水平，明显减小心率和收缩压的降低率，提示侧柏叶对家兔心肌MIRI具有保护作用。

Bernik等[9]研究发现，刺激迷走神经能明显减轻大鼠心肌缺血-再灌注模型的炎症反应，而切断迷走神经后这种保护效应消失。Li等[10]研究也发现，在大鼠心肌缺血-再灌注模型，给予a7烟碱型乙酰胆碱受体激动剂后能明显减少缺血心肌的炎性细胞浸润，降低心肌酶含量，减轻心肌的超微结构损伤。以上结果提示，在一定程度上，迷走神经活性增强能明显减轻心肌MIRI。在本研究中，侧柏叶能明显减小心肌缺血-再灌注后收缩压、心率的降低率，但在迷走神经切断后，侧柏叶的以上保护作用明显减弱，提示迷走神经切断后侧柏叶对心肌MIRI的保护作用明显减小，说明迷走神经在此过程中作用关键。已有研究证实，迷走神经释放的乙酰胆碱通过结合免疫细胞表面的a7烟碱型乙酰胆碱受体阻断NF-κB通路，抑制炎性因子及TNF-a和IL-6等细胞因子的表达。而大量释放的TNF-α和IL-6等却能激活NF-κB通路,下调NOS的表达，诱发细胞凋亡，加重心肌损伤。在本研究中，侧柏叶能明显降低心肌缺血-再灌注后血清TNF-α和IL-6水平，增加血清Ach及心肌组织NOS含量，提示侧柏叶对MIRI的保护作用与胆碱能抗炎通路有关。而迷走神经切断后，侧柏叶的以上作用明显减弱，进一步提示侧柏叶对MIRI的保护作用与胆碱能抗炎通路有关。