共无定形体系提高甲磺酸乐伐替尼的溶出度及消除其凝胶化研究

卢 燕，丛 逢，钱 帅，魏元锋，张建军，林以宁，高 缘*

（1中国药科大学中药学院，南京211198；2中国药科大学药学院，南京211198）

目前，75%的候选药物存在水溶性差、生物利用度低的问题，严重影响其临床疗效［1］，共无定形技术可有效地提高难溶性药物的溶解速率和生物利用度［2］。药物共无定形体系是由两种或两种以上小分子物质（药物或辅料）以一定的化学计量比组合形成的具有单一玻璃化转变温度（Tg）的均匀单相无定形体系［3-4］，该体系中不同组分间可通过氢键、π-π堆积等非共价键连接或无相互作用力结合［5］。本课题组前期研究表明，将难溶性药物制成共无定形物，与无定形药物单体相比，不仅可进一步提高难溶性药物的表观溶解度和溶出速率，提高无定形物的物理稳定性［6-8］，同时可有效地改善一些无定形药物单体的溶解凝胶化现象［9-10］。

甲磺酸乐伐替尼（lenvatinib mesylate，LF，图1-A）是一种多靶点酪氨酸酶抑制剂［11］，对恶性黑色素瘤［12］、肾癌［13］、肝癌［14］、甲状腺癌［15］等均有良好疗效。且由于LF 为靶向药物，对非靶点的细胞和组织损伤较小，比传统抗肿瘤药物不良反应小，有很好的应用前景［16］。但是，LF 在溶出时存在凝胶化现象，该凝胶具有很强黏性，使溶出速度变缓，对其吸收有一定影响。目前原研专利通过加入碳酸钙在胃中促发泡腾作用来减弱其凝胶现象，但会加重LF 引起的胃肠道不良反应［14］。黄芩素（baicalein，BAI，图1-B）是临床上常用的中药黄芩的有效成分，具有抗炎、抗氧化、抑制肿瘤细胞（如乳腺癌［17］、肝癌［18］等）的生长等作用。BAI属于BCS Ⅱ类药物，溶解度极低，口服生物利用度差［19］。本研究选择BAI 作为小分子配体，通过共无定形技术与LF 制备成共无定形物，改变药物固体形态，旨在提高LF 和BAI 的溶出度，并消除LF 的凝胶化现象。

Figure 1 Chemical structures of lenvatinib mesylate（LF）(A) and baicalein（BAI）(B)

1 材 料

1.1 药品与试剂

LF 原料药（纯度：99.9%，南京方生和医药有限公司）；BAI（纯度：99.8%，上海曙灿实业有限公司）；磷酸（色谱纯，阿拉丁试剂有限公司）；甲醇（分析纯，无锡亚盛化工有限公司）；乙酸铵（分析纯，淄博名聚化工有限公司）；乙腈（色谱纯，上海安谱试验科技股份有限公司）；试验用水为Milli-Q水纯化系统（Millipore，美国）滤过水；其余试剂为分析纯。

1.2 仪 器

BS124S、BT25S 电子天平（德国Sartorius 公司）；N-1100 旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；RC-806 智能溶出仪（天津市天大天发科技有限公司）；4350L 液压机（美国Carver 公司）；LC-10AD 高效液相色谱仪（SPD-10A 检测器，LC-Solution 色谱工作站，日本岛津公司）；D8 Advance X 射线衍射仪（德国Bruker AXS 公司）；Affinity-1S 型傅里叶红外光谱仪（日本岛津公司）；204 F1 型差示扫描热分析仪（德国Netzsch公司）；PM6000偏光显微镜（南京江南永新光学有限公司）。

2 方 法

2.1 样品的制备

采用旋转蒸发法制备LF-BAI共无定形物。将LF 与BAI 按1∶1 的物质的量比投料，称取LF 原料药1.2 g 和BAI 0.5 g 于烧杯中，加入甲醇200 mL，溶解，0.22 μm 滤膜过滤后，在45 ℃下旋转蒸发去除溶剂。收集产物于25 ℃真空干燥箱中去除残余溶剂，即得LF-BAI共无定形物。

同时使用上述方法制备LF 和BAI的单独旋转蒸发产物。将LF 原料药与BAI 按物质的量比1∶1混合均匀制备物理混合物（PM）。

2.2 LF-BAI共无定形物的物理化学表征

2.2.1 偏光显微镜（polarizing microscope，PLM）分别取LF 晶体、BAI 晶体以及制备的LF-BAI 共旋转蒸发产物、LF 和BAI 的单独旋转蒸发产物适量置于载玻片上，用液体石蜡均匀分散开，在40×10倍偏光显微镜下观察，图像信息用D3K-MS 软件采集。

2.2.2 X 射线粉末衍射（X-ray powder diffractogram，PXRD） 分别取LF 晶体、BAI 晶体、LF-BAI共旋转蒸发产物、LF-BAI物理混合物PM约200 mg过200 目筛网后，使用X 射线衍射仪进行观测，以Cu 靶Kα 射线为光源，使用石墨单色仪和0.3 mm单针孔准直仪，以反射模式进行样品的PXRD测量。管电压和电流强度分别设定为40 kV 和40 mA，测定波长为1.540 6 Å，步长0.02°，扫描速度为2（°）/min，收集3～40°/2θ范围内的谱图。

2.2.3 差示扫描量热分析（differential scanning calorimetry，DSC） 采用差示扫描热分析仪对LF晶体、BAI 晶体、LF-BAI 共旋转蒸发产物、LF-BAI物理混合物PM 进行热行为测试。将上述样品置于坩埚中，升温速率10 ℃/min，范围为50～300 ℃，氮气保护，流速20 mL/min，数据用PerkinElmer Thermal Analysis软件处理。

2.2.4 傅里叶红外光谱法（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）分别取LF 晶体、BAI 晶体、LF-BAI 共旋转蒸发产物、LF-BAI 物理混合物PM与KBr研匀，压成透明薄片，于红外测定仪中在4 000～400 cm-1的 范 围 内 测 定，数 据 用Nicolet Omnic红外光谱软件（Version 8.0）处理。

2.3 化学计量比测定

精密称取LF-BAI 共旋转蒸发产物10 mg 于100 mL 量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，摇匀。采用以下高效液相检测方法检测，记录峰面积，计算以确证旋蒸产物的结合比例，上述样品平行测定3份。

2.4 HPLC分析方法

采用Ultimate LP C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），检测波长为244 nm，以0.1%磷酸水溶液（乙酸铵调节pH 至4.5）-90%乙腈（40∶60）为流动相，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，进样体积为10 μL。

LF 的线性范围是4～100 μg/mL，BAI 的线性范围是0.2～100 μg/mL，具有良好的线性。该方法分离度良好，重复性好，准确度高。

2.5 溶出度

2.5.1 特性溶出速率（intrinsic dissolution rate，IDR） 特性溶出时药物与溶出介质接触面固定，可以清晰地反映出单位时间内单位面积药物的溶出特性［20］。分别称取LF 晶体、BAI 晶体、LF-BAI共无定形物以及物理混合物（PM）粉末过80 目筛后各150 mg，使用液压机压制成具有一定硬度、表面规整的规则圆形药片，直径约13 mm，面积为1.33 cm2，压制压力为1 T。将片子封入蜂蜡中，使其只有一个圆形表面得与溶出介质接触。按照《中华人民共和国药典》（2015年版）通则0931第二法（桨法）装置，介质为pH 3.0 的磷酸盐缓冲盐溶液500 mL，温度为37 ℃，转速为50 r/min。在溶出过程中，使片子裸露面向下，以维持药片与介质的充分接触，分别在5，10，15，30，45，60，80，120，150，180，210，240 min 取出样液3 mL，并立刻补充等温的溶出介质3 mL。取出样品经0.22 μm亲水PTFE 微孔滤膜过滤，适当稀释后使用高效液相法按照上述色谱条件进行分析，每组样品平行测定3 份。用单位表面积的累积溶出量（mg/cm2）与时间（min）绘制线性回归曲线，该曲线的斜率即为特性溶出速率，计算公式如下：

其中，IDR 为特性溶出速率（mg·min-1·cm-2）；dW为药物溶出的变化量（mg）；dt为时间的变化量（min）；S为药片的表面积（cm2）。

2.5.2 过饱和粉末溶出（supersaturated dissolution）按照《中华人民共和国药典》（2015 版）通则0931 第三法小杯法的条件进行过饱和条件下溶出，以PBS（pH 3.0）250 mL 为溶出介质，温度为37 ℃，转速为50 r/min，分别取过量的LF 晶体、BAI晶体、LF-BAI 共无定形物和PM 粉末过80 目筛后，投入溶出介质中，并在5，10，15，30，45 min 及1，2，4，6，8，12和24 h时取样3 mL，并及时补充等温溶出介质3 mL。取出后的溶液经0.22 μm亲水PTFE微孔滤膜过滤，适当稀释后使用高效液相法按照上述色谱条件进行分析，每组样品平行测定3份。

2.6 稳定性

分别将一定量的LF-BAI 共无定形物放置在25 ℃，60%RH 以及40 ℃，75%RH 条件下，分别于5，10，20，30，60，90 d 取出适量样品使用PLM、PXRD进行分析，观察粉末的物理稳定性。

3 结果与讨论

3.1 LF-BAI的物理化学表征

3.1.1 偏光显微镜分析 如图2 所示，偏光显微镜视野中LF 晶体（图2-A）、BAI 晶体（图2-B）、LF旋蒸产物（图2-C）、BAI 旋蒸产物（图2-D）均有清晰可见的双折射现象，说明无法制得LF 和BAI 的无定形态。而LF-BAI 共旋蒸产物（图2-E）在偏光显微镜下呈现片状，形状不规则，且无晶体特征性的双折射现象，说明为无定形态，且为共无定形物，而非LF、BAI无定形的物理混合物，DSC结果可进一步确定。

Figure 2 Polarizing microscope pictures of crystalline LF (A),crystalline BAI (B), rotary evaporation product of LF (C), rotary evaporation product of BAI(D)and rotary evaporation product of LF-BAI(E)

3.1.2 X 射线粉末衍射法分析 由图3 可知，LF晶体的特征衍射峰位于为6.24°和11.36°，BAI 晶体的特征衍射峰位于10.20°，11.32°，13.20°，15.32°，16.24°，18.28°，21.84°，23.02°，23.80°，26.30°和28.82°。PM 的衍射峰为LF 与BAI 两种晶体特征峰的叠加。二者的共旋转蒸发产物中所有的特征峰均消失，整体为一个较大的衍射环，表明旋蒸产物为无定形态，这也与偏光显微镜下无双折射现象的结果一致。

Figure 3 X-ray powder diffractograms for crystalline LF (a), crystalline BAI(b),LF-BAI physical mixture(c)and coamorphous LF-BAI(d)

3.1.3 差示扫描量热法分析 各样品的DSC 结果如图4 所示，从图中可以看出，LF 晶体在174.6 ℃有一个吸热峰，在223.2 ℃开始放热降解。268.3 ℃为BAI 晶体的熔融吸热峰，与文献的报道一致［19］。晶体的物理混合物的DSC 结果与LF 晶体的DSC结果相近，BAI尖锐的熔融峰消失可能是二者混合后组分之间存在相互影响且组分纯度降低所致的。LF-BAI 共旋蒸产物在118.0 ℃出现单一的玻璃化转变温度（Tg），结合偏光显微镜及PXRD 无晶体衍射峰，表明共旋转蒸发产物为二元单相的无定形体系，即LF-BAI共无定形物。

Figure 4 Differential scanning calorimetry thermograms for crystalline LF (a), crystalline BAI (b), LF-BAI physical mixture (c) and coamorphous LF-BAI(d)

3.1.4 傅里叶红外光谱分析 从图5中可以看出LF（a）中v（N-H）峰的位置是3 467.17 cm-1，与-NH2相连的C=O 的伸缩振动峰为1 693.53 cm-1，BAI（b）中v（O-H）峰的位置是3 412.15 cm-1，v（C=O）峰的位置是1 656.92 cm-1，该峰位BAI 在分子内已经形成了氢键［21］。PM（c）为二者特征峰的叠加，特征峰的位置未发生改变。CM 相比单独晶体峰强度减小，且出现宽化现象，可能是产生了氢键，对比峰的位移，可以发现BAI 中的v（O-H）峰所在的位置在CM 中发生宽化，同时在LF 中的v（C=O）也从1 693.53 cm-1红移到1 681.31 cm-1且宽化现象明显，说明LF-BAI形成共无定形物后，BAI分子内部的氢键缔合体系被破坏，BAI 中的O-H 和LF 中的C=O 形成了分子间氢键，但由于氢键的产生导致CM 的红外图谱严重钝化，无法确定具体成键位点。

3.2 化学计量比测定

Figure 5 Fourier transform infrared spectroscopy spectra for crystalline LF (a), crystalline BAI (b), LF-BAI physical mixture (c) and coamorphous LF-BAI(d)

通过对LF 和BAI 的含量计算可以得出，LF 的含量为理论含量的（101.34±0.27）%，BAI 的含量为理论含量的（100.52 ± 0.84）%，符合理论投样量的比例，可证实BAI 和LF 按照物质的量比1∶1结合。

3.3 溶出度试验

3.3.1 特性溶出速率 LF 晶体在溶出30 min 时LF 片表面就完全凝胶化，PM 片在溶出约1 h 后有凝胶生成，使药片体积膨胀从蜂蜡中掉出，而将LF与BAI制成共无定形物后，溶出全程中未见有凝胶生成，见图6。LF 晶体、BAI 晶体、晶体物理混合物及LF-BAI 共无定形物在PBS（pH 3.0）缓冲液中的特性溶出结果见图7，可以看出，PM 和LF 晶体的特性溶出曲线趋势相似，但由于溶出约1 h 后PM片掉落后暴露面增大，与溶出介质的接触面积增大，所以溶出速率略微高于LF 晶体。相比晶体与PM，CM中的LF溶出较快，但水分会渗入CM片中，使得药片在30 min 后发生破裂，约1 h 后有少量部分药片掉落在溶出介质中，此时CM 中的LF 的溶出速率为晶体的2.2倍。

Figure 6 Intrinsic dissolution phenomenon of crystalline LF tablet,physical mixture (PM) tablet and coamorphous (CM) tablet in PBS (pH 3.0)solution

Figure 7 Intrinsic dissolution of(A)LF,and(B)BAI from crystalline raw material,physical mixture(PM)and coamorphous(CM)system in PBS(pH 3.0)solution(xˉ± s,n = 3)

BAI 在PBS（pH 3.0）中溶出较差，45 min 仍未检出溶出量，PM中的BAI也显示出较低的溶出度，但由于溶出1 h 后PM 片掉出，导致后期溶出速率略高于晶体。而CM 中的BAI 则显示出良好的溶出特性，10 min时即可检测到，前1 h溶出速率保持恒定，为BAI 晶体的25.4 倍。至80 min 后溶出速率稍有下降，溶出曲线呈现凹形，原因可能是CM发生转晶和部分药片掉落后与介质接触面积增大的双重作用结果。

3.3.2 过饱和粉末溶出考察 为了测量共无定形体系中LF 和BAI 的亚稳态溶解度，并确定它们在再结晶前保持的过饱和浓度时间跨度，研究粉末在过饱和条件下的溶出。过饱和溶出投样后，可以观察到LF 和PM 在溶出介质表面围绕着桨形成凝胶，30 min 后药物全部形成片状凝胶，该凝胶发生团聚从界面上沉淀下来，形成团聚的片状凝胶，如图8 所示。CM 过饱和溶出现象与二者有较大区别，溶出时药物均匀地分散在介质中而未形成凝胶。LF 晶体、BAI 晶体、晶体物理混合物和LF-BAI 共无定形物在PBS（pH 3.0）溶液中的过饱和溶出结果见图9。物理混合物的溶出曲线与单独LF 类似，而CM 中LF 呈现快速溶出达到过饱和状态，随着溶出试验的进行，LF浓度逐渐下降至单独LF的溶解度水平，这可能与溶剂介导的LF转晶有关。相比LF的溶出提高，CM 中的BAI前期的溶出提高更为显著，随后由于转晶，介质中的BAI 浓度迅速趋近于其晶体的溶解度。

观察溶出后的干燥样品（图8）可以发现，LF和PM的样品均为半透明的凝胶状，而CM溶出后的样品为黄色细粉状，未见明显凝胶形成。CM 溶出后样品的PXRD 图谱（图10-A）中有明显的尖锐衍射峰，与BAI晶体特征峰相对应，表明CM中BAI已经转晶，但未观察到LF晶体特征峰，其可能是由于LF的结晶度较低，LF 原料药的PXRD 图谱（见图3-a）中的特征衍射峰强度也较低，所以CM 溶出24 h 干燥样品的PXRD 图谱中未观察到LF 晶体特征峰。后将样品进行PLM 观察（图10-B），为清晰可见的双折射现象，表明CM中LF和BAI都已转晶。

3.4 稳定性研究

由图11 看出，长期试验条件（25 °C，60%RH）下，LF-BAI 共无定形物放置90 d 内仍无双折射现象，PXRD 图中亦无晶体的特征衍射峰（图12-A），表明未发生转晶，稳定性良好；由图13 看出，加速试验条件（40°C，75%RH）下LF-BAI共无定形物放置60 d 内仍无双折射现象，放置90 d 后可观察到极少量的双折射现象，有轻微转晶，而PXRD 图中无晶体的特征衍射峰（图12-B），可能是转晶程度未达到PXRD 的检测限。综上表明LF-BAI 无定形物理稳定性良好，提高湿度和温度则会加速其转晶。

Figure 8 Supersaturated dissolution phenomenon of crystalline LF,LF-BAI physical mixture (PM) and coamorphous (CM) in PBS (pH 3.0)solution

Figure 9 Supersaturated dissolution of (A) LF, and (B) BAI form crystalline raw material, physical mixture (PM) and coamorphous (CM) system in PBS(pH 3.0)solution(xˉ± s,n = 3)

Figure 10 X-ray powder diffractogram (A) and polarizing microscope picture (B) for coamorphous LF-BAI dry powder after supersaturated dissolution

Figure 11 Polarizing microscope pictures of coamorphous LF-BAI under long-term testing condition

Figure 12 PXRD patterns of coamorphous LF-BAI under long-term testing condition(A)and accelerated testing condition(B)

Figure 13 Polarizing microscope pictures of coamorphous LF-BAI under accelerated testing condition

4 结 论

本试验采用旋转蒸发法成功制得LF-BAI共无定形物，单一的玻璃化转变温度（Tg）为118.0 ℃，与LF 原料药易出现溶出凝胶化的现象不同，LFBAI 共无定形物在溶出过程中粉末均匀分散在介质中，不形成凝胶。且与LF 晶体、BAI 晶体相比，LF 和BAI 的溶出速率分别提高了2.2 倍和25.4倍。稳定性试验表明，所制备的LF-BAI 共无定形物在加速与长期试验条件下均具有良好的稳定性。这种将难溶性药物LF和合适的配体制成共无定形后具有提高其溶解度及溶出度的优势，且可以有效地抑制LF的凝胶生成，为LF的进一步开发和临床应用提供了新的物质基础。