11种结核分枝杆菌抗原皮肤试验反应效果评价

段惠娟 褚洪迁 孔成成 戴广明 曹廷明 孙照刚

结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)试验广泛用于结核病流行病学调查、卡介苗(BCG)接种检测、结核病筛查，以及结核病临床诊断等方面。但由于PPD是多种抗原的混合物，其结果受到BCG接种及其他分枝杆菌感染的影响，诊断特异度低[1]。因此，在BCG普遍接种的地区，PPD试验用于结核分枝杆菌(MTB)感染检测受到了较大限制。近年来，利用结核分枝杆菌复合群(MTBC)中不同细菌[如MTB、牛分枝杆菌或BCG基因组中存在的缺失片段(RD区)]的特异性，为开发新的高特异性诊断试剂提供了研究方向[2]。目前，重组结核杆菌融合蛋白(EC)[结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)重组融合蛋白]已作为新型MTB感染皮肤试验的检测试剂通过了国家药品监督管理局药品审批而准予上市[3]，能有效区分MTB感染和BCG接种。除此之外，对MPT64、Rv1985c、Rv0222、Rv3117及Rv3120等相关蛋白的研究表明，它们在结核病血清学诊断方面具有一定的潜力[4-7]，但用于MTB感染皮肤试验鲜有报道。本研究筛选并表达了来自RD1、RD2、RD4、RD5、RD7、RD9、RD11区及MTB休眠相关抗原的12种重组抗原，以了解这些抗原用于MTB感染皮肤试验的诊断效果。

材料和方法

一、实验菌株

MTB标准株(H37Rv，ATCC27294)由首都医科大学附属北京胸科医院北京结核病临床数据和样本资源库提供，接种在中性改良罗氏培养基上放入37 ℃培养箱中培养3～4周。

二、实验动物

无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级豚鼠，雌性，体质量250～300 g，共18只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0011。

三、皮肤试验抗原

1.标准品：50 IU TB-PPD(产品批号：20190510)购自北京祥瑞生物制品有限公司。

2.MTB特异性抗原：(1)筛选蛋白标准：①RD区抗原：在BCG中缺失，均能引起T细胞反应；②MTB 休眠相关抗原：与结核分枝杆菌潜伏感染(LTBI)有关。(2)抗原：共表达12种抗原(表1)；(3)蛋白的表达纯化：①根据GenBank数据库中MTB中各抗原的基因序列设计合成引物；②PCR扩增；③构建重组质粒及转化至大肠杆菌；④进行蛋白的诱导表达及纯化，其中，包涵体形式的蛋白在表达后，将超声破碎后的菌液离心去上清，沉淀用适当体积的8 mol/L尿素充分溶解，再离心取上清，再将其稀释为 20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，4 mol/L尿素，pH 8.0 体系。再次离心，取上清，进行纯化，纯化后电泳。

四、MTB特异性抗原皮肤试验浓度

1.EC抗原：稀释终浓度至5 μg/ml。

2.其他抗原：将各抗原浓度分别用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至终浓度为50 μg/ml、5 μg/ml、1 μg/ml。本研究抗原浓度均根据EC浓度注射，EC皮肤试验注射量为每0.1 ml剂量0.5 μg[8-9]和0.1 μg[1]。考虑到本实验均为单个抗原，因此，在此基础上将抗原最高浓度提高至每0.1 ml剂量5 μg。

表1 用于豚鼠皮肤试验所筛选的结核分枝杆菌抗原

五、豚鼠致敏及皮肤试验

1.分组：共18只豚鼠，分为高(5 μg)、中(0.5 μg)、低(0.1 μg)剂量3组，每组6只，每只豚鼠注射6种蛋白，重复3次。

2.致敏豚鼠：(1)准备菌液：磨菌，测量菌液在波长600 nm处的吸光度(A600)值，使A600=1[菌液浓度为3.8×108菌落形成单位(CFU)/ml]，稀释10倍，使菌液终浓度为3.8×107CFU/ml。(2)致敏：每只豚鼠大腿腹股沟皮下注射0.5 ml H37Rv菌液，感染4周。

3.皮肤试验：豚鼠背部去毛，用1 ml注射器皮内注射。TB-PPD和各抗原均注射0.1 ml，注射24 h 和48 h后测量硬结横径和纵径，计算硬结平均直径[(横径+纵径)/2]。

4.判断标准：以硬结平均直径<5 mm为阴性，≥5 mm为阳性，凡有水疱和坏死者均属于强阳性反应[3, 8]。

六、统计学处理

用Microsoft Excel 2010进行统计，用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料为偏态分布，以“中位数(四分位数)[M(Q1，Q3)]”表示，采用配对样本比较的Wilcoxon符号秩检验分析各抗原注射24 h和48 h后硬结平均直径的差异；采用Kruskal-WallisH检验比较多组抗原之间硬结平均直径的差异，双侧检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、抗原表达纯化结果

共表达12种MTB抗原，其中8种为包涵体形式，采用BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量法检测蛋白浓度，结果见表2。

表2 12种结核分枝杆菌抗原的表达纯化情况

二、各抗原皮肤试验反应情况

抗原剂量为5 μg时，多数抗原皮肤试验反应24 h 时的硬结平均直径均大于反应48 h，差异均有统计学意义；而MPT64、Rv1985c、Rv0222和Rv1738等皮肤试验反应24 h和48 h的硬结平均直径差异均无统计学意义(表3)。抗原剂量为0.5 μg时，Rv1985c和Rv1738皮肤试验无任何反应；Rv3872、Rv0222、Rv3619c、Rv3425和Rv2626c等皮肤试验反应24 h和48 h的硬结平均直径差异均无统计学意义，其他抗原皮肤试验反应24 h的硬结平均直径均大于反应48 h(表4)。抗原剂量为0.1 μg 时，11种抗原皮试均无任何反应。皮肤试验反应24 h时，TB-PPD(5 IU)和EC(0.5 μg剂量)的反应均为阳性(9/9，9/9)；在5 μg剂量时，Rv3120和Rv3619c的皮肤试验效果相对较好，反应阳性率分别为9/9、8/9；在0.5 μg剂量时，MPT64和Rv3120的皮肤试验效果相对较好，反应阳性率分别为7/7、6/7。MPT64(0.5 μg剂量)、Rv3120(5 μg剂量)和Rv3619c(5 μg剂量)皮肤试验反应24 h硬结平均直径中位数均>5 mm。

三、几种优势抗原皮肤试验结果分析

皮肤试验反应24 h时，TB-PPD(5 IU)、EC(0.5 μg 剂量)、MPT64(0.5 μg剂量)、Rv3120(5 μg剂量)和Rv3619c(5 μg剂量)硬结平均直径差异有统计学意义(χ2=25.064，P=0.000)；EC(0.5 μg剂量)硬结平均直径明显大于TB-PPD(5 IU)，有统计学差异(H=-2.976，P=0.029)。MPT64(0.5 μg剂量)、Rv3120(5 μg剂量)和Rv3619c(5 μg剂量)与TB-PPD(5 IU)硬结平均直径接近，差异均无统计学意义(H值分别为-0.496、0.819和1.714，P值分别为1.000、1.000和0.865)；MPT64(0.5 μg剂量)与EC(0.5 μg剂量)硬结平均直径接近，差异无统计学意义(H=2.288，P=0.221)。Rv3120(5 μg剂量)和Rv3619c(5 μg剂量)硬结平均直径均小于EC(0.5 μg剂量)，差异有统计学意义(H值分别为3.795和4.690，P值分别为0.001和0.000)。

表3 抗原剂量为5 μg时豚鼠皮肤试验反应不同时间硬结平均直径[mm，M(Q1，Q3)]

表4 抗原剂量为0.5 μg时豚鼠皮肤试验反应不同时间硬结平均直径[mm，M(Q1，Q3)]

皮肤试验反应48 h时，TB-PPD(5 IU)、EC(0.5 μg 剂量)、MPT64(0.5 μg剂量)、Rv3120(5 μg剂量)和Rv3619c(5 μg剂量)硬结平均直径差异有统计学意义(χ2=24.801，P=0.000)。TB-PPD(5 IU)和EC(0.5 μg剂量)硬结平均直径差异无统计学意义(H=-1.573，P=1.000)；MPT64(0.5 μg 剂量)、Rv3120(5 μg剂量)和Rv3619c(5 μg剂量)与TB-PPD(5 IU)硬结平均直径接近，差异均无统计学意义(H值分别为-0.262、2.241和2.608，P值分别为1.000、0.250和0.091)； MPT64(0.5 μg剂量)与EC(0.5 μg剂量)硬结平均直径接近，差异无统计学意义(H=1.209，P=1.000)；Rv3120(5 μg 剂量)和Rv3619c(5 μg剂量)硬结平均直径均小于EC(0.5 μg剂量)，差异均有统计学意义(H分别为3.814和4.181，P分别为0.001和0.000)。

讨 论

目前，对MTB感染皮肤试验抗原成分的研究是提高结核病诊断的重要方法。通过对RD区的研究，发现利用BCG的缺失区以及采用不同的缺失区蛋白抗原联合进行皮肤试验，可以在一定程度上提高其对结核病诊断的特异性和敏感性[10]。RD1区的EC抗原是近年来研究较多的抗原，其具有较高特异性，但敏感性尚不尽如人意[11]。而且，Hur等[12]提出由于MTB抗原表位的复杂性及患者免疫功能的个体差异，基于此融合抗原的检测仍然存在局限性，仅依靠EC抗原多肽不足以覆盖MTB引起宿主免疫反应的所有表位。因此，本研究表达了除EC抗原以外的11种抗原，对RD区及MTB休眠相关抗原的皮肤试验效果进行研究，以了解其他抗原引起的迟发型超敏反应(delayed-type hypersensitivity，DTH)，提高其诊断结核病的特异性和敏感性。

豚鼠皮肤试验反应出现的时间较早，一般在注射24 h后反应就出现且比较恒定[8]。本研究结果显示，剂量为5 μg或0.5 μg时，多数抗原的皮肤试验反应24 h时硬结平均直径均明显大于反应48 h，包括皮试效果相对较好的抗原Rv3120(5 μg剂量)、Rv3619c(5 μg剂量)和MPT64(0.5 μg剂量)在24 h 和48 h硬结平均直径均有显著差异，与都伟欣等[8]的报道不一致。究其原因，可能是MTB致敏浓度及豚鼠的个体差异所致。MTB通常在感染机体4周时达到稳定生长期，但其稳定期的细菌数与最初感染的细菌数量有关，而且MTB的浓度高低对机体免疫能力的影响有一定的差异[13-14]。

皮肤试验反应硬结的大小，与皮试抗原剂量的多少有一定的关系[15]。本研究结果显示，多数抗原5 μg剂量，比0.5 μg剂量的皮试反应效果好，而MPT64则在剂量为0.5 μg时皮试反应效果相对较好。其中，皮试反应效果相对较好的Rv3120(5 μg剂量)、Rv3619c(5 μg剂量)和MPT64(0.5 μg剂量)的反应阳性率分别为9/9、8/9和7/7。Rv3120(5 μg剂量)和MPT64(0.5 μg剂量)与TB-PPD(5 IU)皮肤试验反应(24 h)硬结平均直径差异均无统计学意义，而且其反应均为阳性(硬结平均直径≥5 mm)，表明这两种抗原具有较好的免疫原性。MPT64是MTB早期培养滤液主要的分泌蛋白之一，对MTBC有高特异性[6]。其能刺激γ干扰素(IFN-γ)的释放，诱导细胞免疫反应，引起小鼠和豚鼠的T细胞反应和DTH[16-17]。重组蛋白CFP21-MPT64在检测LTBI家庭密切接触者时的敏感度(66.7%)略高于PPD皮肤试验(61.1%)[6]。因此，可考虑将MPT64与其他抗原联合使用，进一步研究。Rv3120属于RD5区抗原，是一种假定蛋白，虽与重组结核杆菌融合蛋白(EC)相比(24 h和48 h)，皮试反应大小有显著差异，但Zhang等[5]对60例HIV阴性肺结核患者和32名健康对照者的血清进行酶联免疫吸附试验，结果显示，与已知抗原ESAT-6(敏感度为21.7%，特异度为90.6%)相比，Rv3120抗原具有更高的敏感度和特异度(敏感度为31.7%，特异度为96.9%)，可作为结核病免疫诊断的候选蛋白。Rv3619c属于ESAT-6家族的早期分泌性抗原，能诱导抗原特异性IFN-γ的分泌和Th1型反应。研究证明，Rv3619c能诱导MTB感染的豚鼠发生DTH，是有效的T细胞抗原[18-20]。本研究结果显示，Rv3619c(5 μg剂量)皮肤试验反应(24 h)硬结平均直径明显小于TB-PPD(5 IU)和EC，但其硬结平均直径大于阳性临界值(5 mm)，反应阳性率较高(8/9)，在结核病诊断中有潜在价值。研究表明，部分MTB休眠相关抗原在LTBI人群中诱导的T细胞反应要明显强于结核病患者[21]，而且不同抗原在LTBI人群中的血清抗体水平也不一样[22]。本研究中，MTB休眠相关抗原Rv1738和Rv2626c在致敏豚鼠身上均未能显示出明显的DTH反应，其可能原因是感染后的豚鼠已处于MTB活跃状态；同时，推测DTH主要由早期表达的蛋白引起，尤其是早期分泌型的蛋白。这为进一步优化皮肤试验试剂提供了研发方向。

目前，检测MTB感染的皮肤试验试剂不断改进，在使用效果方面，在减轻和减少不良反应的同时，DTH的特征更加明显，特异性和敏感性也进入一个新的高度。但是，目前新型的以ESAT-6和CFP-10抗原为主的C-Tb试剂仍然存在红肿发生率高[23]，DTH表现不够明显的问题；而抗原的联合使用有助于提高MTB感染的诊断效果[24]。本研究目前尚处于蛋白抗原筛选阶段，深入的蛋白组合及其最优剂量等方面尚需进一步研究，以期克服目前重组抗原EC等试剂存在的不足。