止咳枇杷合剂干预新型冠状病毒肺炎的作用机制预测

周 瑞，刘妍如，许洪波，于金高，王 征，张君威，宋忠兴，黄 峰，唐志书

(1. 陕西中医药大学陕西中药资源产业化省部共建协同创新中心，秦药特色资源研究与开发国家重点实验室(培育)，陕西省创新药物研究中心，陕西咸阳 712083；2. 陕西中医药大学制药厂，陕西咸阳 712046)

新型冠状病毒(2019-nCoV, SARS-CoV-2)与SARS冠状病毒是同一类，但不是同一种[1]。2020年2月11日世界卫生组织(WHO)将其感染所致的疾病命名为新型冠状病毒肺炎(novel coronavirus disease 2019, COVID-19)。2020年3月11日，WHO将COVID-19确定为全球大流行。目前，全球疫情防控形势仍十分严峻。经过全国范围内的联防联控措施，我国疫情已基本稳定。该病前期主要表现为发热、乏力、干咳，少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹泻等；重症患者出现呼吸困难和低氧血症；危重症患者出现急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)、脓毒症休克及多器官功能衰竭等[2-4]。临床主要采用中西医结合对症治疗，取得了很好的治疗效果[5-6]。

中医认为咳嗽缘于外感六淫、内伤七情导致肺失宣发肃降，肺气上逆，气机紊乱，现代医学认为咳嗽是上呼吸道和肺脏自身炎症的表现，咳嗽也归属于肺系炎症的范畴，细菌、病毒感染引起的肺炎是咳嗽最常见的原因[7-8]。止咳枇杷合剂是临床治疗咳嗽的有效方剂，主要针对肺失肃降而设，方中枇杷叶、白前、桔梗降肺气止咳为君药，百部敛肺止咳、桑白皮清热止咳共为臣药，佐以薄荷清热解表开宣肺气，主药合用达到宣肺降气、敛肺止咳之目的。COVID-19主要临床表现肺失宣发肃降病机，推测该方可能通过宣肺止咳，有效阻断COVID-19病情进展。

网络药理学融合了生物信息学和计算机科学等方法，与分子对接技术结合研究中药的物质基础及作用机制[9-12]，能充分体现中药治疗疾病“多成分、多靶点、多途径”的优势，为实验提供了强有力的数据支撑。本研究通过网络药理学筛选出止咳枇杷合剂的作用靶点，并进行聚类分析，预测其具有抗COVID-19作用的核心活性化合物，进而运用分析软件对中药-化合物-靶点进行信号通路分析，预测其治疗COVID-19的作用机制，并通过分子对接筛选枇杷合剂中核心抗病毒化学成分，为止咳枇杷合剂用于治疗COVID-19提供理论参考。

1 资料与方法

1.1 止咳枇杷合剂干预COVID-19的可行性

1.1.1化学成分的收集及筛选 借助中药系统药理学分析平台(TCMSP)(http://tcmspw.com/)数据库检索，以止咳枇杷合剂组方中药“枇杷叶”、“桑白皮”、“白前”、“百部”、“桔梗”、“薄荷脑”为关键词检索，收集组方中药的主要化学成分。进一步以口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥ 30%或类药性(drug likeness, DL)≥ 0.18作为条件，对化合物进行进一步筛选。

1.1.2“化合物-疾病靶点”筛选及“成分-疾病-靶点”网络构建 从TCMSP、Drugbank(https://www.drugbank.ca/)、Pubchem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中搜索化合物对应的靶点，以UniProt数据库(http://www.uniprot.org/uniprot/)对收集的靶点进行规范化和校正，得到成分相关的基因靶点。在MalaCards数据库(https://www.malacards.org/)、TTD数据库(therapeutic targets database，http://bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp)和OMIM数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)中，输入关键词 “SARS(severe acute respiratory syndrome)”、“Respiratory Failure”，搜索已报道的与冠状病毒感染相关的基因。剔除重复和假阳性基因后，建立冠状病毒感染相关的靶点基因列表。

将获得的化合物相关靶点和疾病相关靶点以Venn工具(2.1.0，https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)取靶点交集。将交集内靶点导入STRING 11.0数据库(https://string-db.org/)，以人类(Homosapiens)为种属，查询蛋白相互作用信息，从而构建PPI(protein to protein interaction)网络。整合PPI网络的蛋白互作信息，“成分-疾病-靶点”及“中药-成分”信息，将数据导入Cytoscape 3.7.2(http://www.cytoscape.org/)软件，构建“中药-成分-疾病-靶点”预测网络。以网络的节点和边线来描述化合物与中药、疾病和靶点之间的关系，以Cytoscape 的Network analysis插件分析并提取网络节点和边的特征。

1.1.3生物过程注释及靶点的通路分析 为了分析止咳枇杷合剂的作用机制，采用R软件包(3.6.2)的Cluster profiler包对交集靶点进行GO(gene ontology)生物信息学富集分析，用3个本体(Ontology)描述基因靶点的分子功能(molecular function, MF)、所处的细胞位置(cellular component, CC)和参与的生物过程(biological process, BP)。然后以KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，https://www.kegg.jp/)数据库对靶点基因参与的主要生化代谢途径进行富集和注释，显著性差异设定卡值为P<0.05，采用ggplot2包对GO和KEGG通路富集结果进行可视化处理。

1.2 枇杷止咳合剂抗2019-nCoV的活性化合物预测

1.2.1靶点与配体的预处理 以上海科技大学饶子和/杨海涛课题组公布的COVID-19 3CLpro高分辨率晶体结构(PDB ID：6LU7)为对接模板，采用Schrodinger-2018软件的Protein preparation wizard模块对6LU7结构进行加氢、去水、去杂原子等预处理。以6LU7原配体化合物为参照，以“1.1.1”项中筛选的活性成分为对接配体，采用Ligprep模块对各成分结构(*.sdf)进行加氢等优化预处理后生成批量处理文件。

1.2.2分子对接 以原始配体分子为中心，采用Receptor Grid Generation模块生成格点文件(盒子大小设为14Å)。以6LU7作为刚性受体，止咳枇杷合剂活性成分结构作为构象可变化(柔性)配体，进行半柔性对接。

2 结 果

2.1 止咳枇杷合剂干预COVID-19的网络构建

2.1.1活性成分筛选 结合TCMSP数据库和中国天然产物化学数据库收载的止咳枇杷合剂组方中药成分，基于样本量、后续数据分析的复杂性以及研究价值的考虑，以口服生物利用度(OB)≥30%或类药性(DL)≥0.18作为进一步筛选条件，得到符合筛选标准的活性化合物179个。

2.1.2“成分-疾病-靶点”筛选 通过TCMSP平台数据库中找到止咳枇杷合剂179个活性成分所对应的靶点共322个，以Uniprot数据库搜索校正后生成“成分-靶点”集合。从MalaCards数据库、TTD数据库和OMIM 数据库中得到关于冠状病毒 “SARS”和“respiratory failure”相关的靶点共计144个，生成“疾病-靶点”集合。将上述得到的“成分-靶点”和“疾病-靶点”集合以Venn工具2.1.0取靶点交集，得到交集靶点30个(图1A)。将交集内靶点导入STRING 11.0，构建蛋白与蛋白作用(PPI)网络(图1B)。

图1 止咳枇杷合剂中化学成分靶点与疾病网络交集(A)及PPI网络(B)Fig.1 Intersection network of the compounds and disease target of Zhikepipa Heji (A) and protein to protein interaction (B)

2.1.3“中药-成分-靶点”网络构建分析 将2.1.2项中筛选得到的30个疾病靶点与中药进行映射，筛选出34个核心化学成分，将6个中药、34个成分及30个疾病靶点进行映射并生成关联表，与PPI网络生成的互作表导入Cytoscape3.7.2软件构建止咳枇杷合剂的“中药-化合物-靶点”关联网络(图2)，图中共涉及70个节点，400个边。不同颜色的圆点代表了止咳枇杷合剂中的中药-成分-靶点网络。分析6种中药在网络图的连接度值可知，君药枇杷叶度值最高(度值=48)，其次是百部(度值=22)，体现出君药枇杷叶在整个复方中的重要作用。分析化学成分的连接度值，发现来自枇杷叶的活性成分槲皮素(MOL000098，quercetin)和芹菜素(MOL000008，apigenin)度值分别为42和12，其次是来自薄荷的(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯[MOL006821，(-)-epigallocatechin-3-gallate]的度值为18，还有来自枇杷叶的成分芦丁(MOL000415，rutin)和山奈酚(MOL000422，kaempferol)度值为10。由此可以看出，止咳枇杷合剂中治疗疾病的主要活性成分为槲皮素、(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯、芹菜素、芦丁及山奈酚等。

图2 止咳枇杷合剂中“中药-成分-靶点”网络图Fig.2 The target network diagram of the compounds of Zhikepipa Heji

橘色节点代表中药，蓝色节点代表活性成分，黄色节点代表疾病靶点。图中节点大小代表度数大小，度数越大，说明该节点在网络中越重要，接近中心度越大，说明节点在网络中越接近中性。

通过对靶点连接点度值分析得出，排名前6位的靶点分别是前列腺素内过氧化物合酶1(PTGS1)(度值=30)、IL1B(度值=29)、IL6(度值=28)、IL10(度值=27)、CXCL8(度值=26)以及JUN(度值=25)。这说明止咳枇杷合剂可能主要通过抗炎、调节免疫实现治疗疾病的作用，此结果初步阐明“中药-成分-靶点”的互作关系以及在整个复方中的定位。初步说明了止咳枇杷合剂治疗疾病的多靶点、多途径属性，其中枇杷叶节点度数较大，说明其君药的用药合理性。此结果表明止咳枇杷合剂通过多成分、多靶点协同作用治疗疾病。

2.1.4枇杷止咳合剂干预COVID-19的生物信息富集及代谢通路注释 将“中药-成分-疾病”网络中筛选的对应的30个靶点通过Cluster profiler进行GO富集分析和KEGG通路注释，共富集到GO条目2 789个，其中生物学过程(BP)2 504条，分子功能(CC)99条，细胞组成(MF)条目195条，分别占89.5%、3.5%、7%(图3)。

图3 止咳枇杷合剂作用靶点的GO分析富集图Fig.3 GO enrichment analysis of the targets of Zhikepipa Heji

富集到KEGG信号通路282条(图4)，这些靶点主要分布于细胞膜外(GO:0045121，membrane raft)、细胞膜微区(GO:0098857，membrane microdomain)、细胞膜区域(GO:0098589，membrane region)；其分子功能主要与细胞核受体活性(GO:0004879, nuclear receptor activity)、转录因子活性(GO:0098531，transcription factor activity, direct ligand regulated sequence-specific DNA binding)、G蛋白耦联胺受体活性(GO:0008227，G protein-coupled amine receptor activity)有关；其生物学途径(BP)主要涉及营养水平反应(GO:0031667，response to nutrient levels)、氧化应激反应(GO:0006979，response to oxidative stress)和脂多糖反应(GO:0032496，response to lipopolysaccharide)。

图4 止咳枇杷合剂KEGG富集分析图Fig.4 Analysis of KEGG enrichment in 10 pathways as targets of Zhikepipa Heji

这些靶点主要调控的代谢通路为乙型肝炎(hsa05161, Hepatitis B)、糖尿病并发症AGE-RAGE通路(hsa04933, AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、动脉粥样硬化流体剪切力(hsa05418，fluid shear stress and atherosclerosis)、IL-17信号通路(hsa04657, IL-17 signaling pathway)、肿瘤坏死因子信号通路(hsa04668，TNF signaling pathway)等。以上结果表明，止咳枇杷合剂中核心化合物可能通过干预环氧合酶1、IL1B、IL6、IL10、IL8等炎症靶点，并作用于乙型肝炎、糖尿病并发症AGE-RAGE通路、IL-17信号通路及TNF信号通路等减轻病毒诱发的炎症风暴损伤和氧化应激损伤，实现干预COVID-19患者的发热咳嗽等症状。

2.2 止咳枇杷合剂中潜在2019-nCoV 3CLpro(PDB ID：6LU7)抑制剂的筛选将对接前后的6LU7原始配体进行构象叠合来验证对接方法的准确度，叠加结果显示均方根偏差(RMSD)值为1.2813Å<2Å，说明该对接体系可以用于配体化合物与6LU7的对接。分子对接的打分值(docking score)绝对值越大说明配体-受体亲和力越强，两者结合越牢固。将“1.1.2”项中“中药-成分-疾病-靶点”网络中的34个化合物与6LU7体系(包括预处理受体和格点文件)进行对接测试，以对接打分值绝对值高于6.0作为筛选条件。结果得到符合筛选标准的化合物8个(表1)，大多数化合物为黄酮类化学物。

表1 止咳枇杷合剂中核心化合物与2019-nCoV 3CLpro(PDB ID：6LU7)对接的结合能力Tab.1 The combining activity of the core compounds from Zhikepipa Heji with 2019-nCoV 3CLpro

3 讨 论

目前对COVID-19的治疗仍缺乏特效药物以及治疗方案。临床数据显示，一些患者在短期内出现多器官衰竭等导致死亡，并且有资料表明此现象可能与机体感染病毒后产生的“细胞因子风暴”有关[13-14]。中医认为COVID-19属于“疫”病范畴，病因为感受“疫戾”之气，主要伤及肺脾[15-16]，初期主要表现为发热、咳嗽。止咳枇杷合剂是临床治疗咳嗽的有效方剂，早期干预可能有效阻断病情进展、预防炎症风暴发生。

本研究用网络药理学系统分析了止咳枇杷合剂对COVID-19的潜在作用机制。首先通过TCMSP，查询获取止咳枇杷合剂中各个中药的活性成分及其作用靶点，通过UniProt、GeneCards等数据库查询靶点对应的基因，然后构建中药活性成分-靶点进行分析，找到止咳枇杷合剂的179个活性成分及其对应的322个潜在作用靶点，同时与找到冠状病毒“SARS”和“Respiratory Failure”相关的144个靶点，再与止咳枇杷合剂活性成分-靶点网络进行交集分析，初步筛选出止咳枇杷合剂核心活性成分共34个，包括槲皮素、(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯、山奈酚、芹菜素等，以及对应的疾病靶点30个。

细胞因子和炎症趋化因子在病毒感染疾病的免疫应答及免疫病理损伤中有非常重要的作用[17-18]，已证实中医药在防治炎症因子风暴方面独具优势[19-20]。当病毒入侵机体后，通过上呼吸道进入支气管和肺泡，机体在受到病毒感染后会激发自身免疫应答。文献已证实，冠状病毒感染后会在体内诱发异常的炎症因子风暴，导致机体组织器官的炎症损伤[21]。因此，抑制COVID-19中炎症因子的产生是药物治疗的主要目标之一。网络药理学结果分析活性成分作用的主要疾病靶点为与炎症免疫密切相关的靶点，尤其是IL1B、IL6、IL10、CXCL8靶点相关的且排名前6位的通路，发现止咳枇杷合剂的活性成分对炎症细胞因子通路如乙型肝炎信号通路、IL-17信号通路、肿瘤坏死因子通路等具有较强的作用，推测止咳枇杷合剂可能通过调节这些信号通路抑制炎症因子风暴，起到消炎止咳的作用。已有多个研究证实了2019-nCoV 3CLpro水解酶可以作为抗病毒药物靶标筛选的重要蛋白[22]。为了更好揭示止咳枇杷合剂中的核心活性成分，本研究利用分子对接技术研究了核心活性成分对2019-nCoV 3CLpro水解酶的抑制作用。一般认为打分值(docking score)绝对值大于5.0则表明分子与靶点有较好的结合活性，大于7.0则说明具有强烈的结合活性[23]。结果发现，止咳枇杷合剂中的核心化合物柚皮素、芦丁、芹菜素及山奈酚的打分值绝对值大于7，表明止咳枇杷合剂中的核心化学成分具有潜在的抗病毒活性。

综上所述，本研究对止咳枇杷合剂干预COVID-19的活性成分、靶点及通路进行了探索性研究，并筛选了其抗2019-nCoV的活性成分。结果初步表明，止咳枇杷合剂中枇杷叶和百部是“中药-成分-靶点-通路”网络中的重点中药，其黄酮类成分如柚皮素、芦丁、芹菜素等是其抗炎、抗病毒的主要成分。综合代谢通路注释结果说明止咳枇杷合剂可通过多成分、多靶点、多通路干预疾病的特点。虽然有研究显示COVID-19的基因组与“SARS”的同源性高达79%[24]，且其主要临床症状为呼吸系统障碍[25]。但是从目前COVID-19全球传播，且防治难度大的现实分析，通过“SARS”和“Respiratory Failure”为主要靶点预测药物抗COVID-19的靶点存在一定的局限性。本研究结果仅初步预测止咳枇杷合剂抗COVID-19的潜在作用机制及活性成分。因此，本课题组将持续开展评价物质基础-药效学-代谢组学-分子机制验证等实验研究，为止咳枇杷合剂治疗COVID-19提供理论基础。