把天门化学成分预试验及其总黄酮含量测定

张 莹，傅 静，王孝勋，钟秋节，俞 鹏

（广西中医药大学药学院，南宁 530200）

把天门为豆科胡枝子属植物美丽胡枝子（Les⁃pedeza formosa）的根，又名三妹木、谋见亮［1］，广泛分布于广西、广东、陕西、江苏、甘肃、浙江、安徽、江西、湖北、福建、台湾、四川、贵州、云南等省区［2］。广西主产于柳州、梧州、桂林、南宁等地，是瑶族地区的民间常用药［1］。中医认为其味微辛涩，性微温，具有活血散瘀、消肿止痛之功，主治跌打肿痛、风湿骨痛、肺痈［3］。瑶医认为把天门具有清热凉血、活血散瘀、消肿止痛、利尿、止血、润肺、祛风湿的功效；主要用于风湿骨痛、关节痛、腰腿痛、跌打损伤、骨折、脱臼等症［1］。目前国内外学者对美丽胡枝子化学成分的研究较少，仅有Li 等［4］从安徽产美丽胡枝子根皮中分离得到2 个新的黄酮类成分，命名为Lespedezaflava⁃none F和Lespedezaflavanone G。吴和珍等［5］研究发现湖北产美丽胡枝子的根皮中含有槲皮苷。傅静等［6］建立了广西产美丽胡枝子茎叶的HPLC 指纹图谱，采用对照品指认了3 个黄酮类成分，分别为夏佛塔苷、牡荊素及异牡荊素。现代药理试验表明，黄酮类化合物具有抗炎镇痛、抗肿瘤、抗心律失常、抗心肌缺血、降压等作用［7］，疗效显著。本试验首次采用系统预试验法对把天门的化学成分进行较全面的研究，建立其总黄酮含量测定的方法，为其活性成分的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

把天门药材于2018 年4 月至2019 年8 月采自广西壮族自治区不同市县，共10 批，经广西中医药大学韦松基教授鉴定为豆科胡枝子属植物美丽胡枝子的根，标本存于广西壮瑶药重点实验室，样品信息见表1。芦丁对照品，中国食品药品检定研究院，批号：100080-201811；95%乙醇、石油醚（60～90 ℃）、氯仿、醋酐、氨水、盐酸、浓硫酸、氢氧化钾、氢氧化钠、碘化铋钾、α-萘酚、茚三酮、三氯化铁、镁粉、磷钼酸、冰乙酸等均为分析纯，水为去离子水，其余试剂自制。

1.2 仪器

HH-6 数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；BP211D 型电子分析天平，德国赛多利斯公司；ZF-20C 型暗箱三用紫外分析仪，上海精密仪器仪表有限公司；RS-232 精密电子天平，丹纳赫西特传感工业控制天津有限公司；UV-2600 紫外可见分光光度计，岛津仪器苏州有限公司。

表1 把天门样品信息

1.3 方法

1.3.1 化学成分预试验

1）水供试液的制备。取把天门药材粉末10 g，置于250 mL 锥形瓶中，加去离子水100 mL，室温浸泡24 h，过滤出约20 mL 滤液检测氨基酸、多肽、蛋白质。将剩余的冷水浸泡液连同残渣置于60 ℃左右水浴加热30 min，趁热过滤，滤液检测糖、多糖、有机酸、皂苷、苷类、酚类、鞣质［8］。

2）乙醇供试液、酸水供试液的制备。称取把天门药材粉末10 g，置于250 mL 锥形瓶中，加95%乙醇100 mL，水浴加热回流1 h，稍冷后加入去离子水使其含醇量为70%。冷却至室温，过滤，滤液分成2份，一份滤液浓缩成膏状，加5%盐酸5 mL 使溶解，过滤，酸水溶液用于生物碱的定性检测。另一份滤液用于黄酮、酚类、蒽醌、内酯、香豆素、强心苷、萜类、甾体、有机酸、酚类等化合物的定性检测［8］。

3）石油醚供试液的制备。取把天门药材粉末1 g，置于50 mL 锥形瓶中，加石油醚（60～90 ℃）10 mL，室温浸泡3 h，过滤，滤液用于油脂、挥发油检测［8］。

1.3.2 总黄酮含量测定

1）对照品溶液的制备。精密称取120 ℃干燥至恒重的芦丁对照品10 mg，置于50 mL 容量瓶中，加70%乙醇定容，摇匀，即得浓度为0.200 mg/mL 的芦丁对照品溶液。

2）供试品溶液的制备。取把天门药材粉末约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，称重，回流提取60 min，冷却至室温，称重，用相应溶剂补足减失的重量，过滤，滤液即为供试品溶液。

3）测定方法。精密移取供试品溶液1 mL，置于100 mL 容量瓶中，加1%三氯化铝溶液1 mL，加去离子水定容，摇匀，放置20 min，以相应溶剂为空白，于波长275 nm 处测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 系统性试验

2.1.1 线性关系考察 精密吸取芦丁对照品溶液（0.200 mg/mL）0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，按确定的显色条件显色，以相应溶剂为对照，于275 nm 波长处测定吸光度。以对照品溶液的吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。计算得到回归方程为Y=35.142 2X+0.040 645 3，r=0.999 6，表明芦丁在 0.004～0.040 mg/mL 呈良好的线性关系。

2.1.2 精密度试验 精密量取供试品溶液（BTM-2）1 mL，置于100 mL 容量瓶中，按确定的测定方法测定吸光度，重复测定6 次，记录供试品溶液的吸光度，RSD为0.06%，说明仪器精密度良好。

2.1.3 稳定性试验 精密量取供试品溶液（BTM-2）1 mL，置于100 mL 容量瓶中，按确定的测定方法每隔10 min 进行1 次吸光度测定，记录120 min 内供试品溶液的吸光度，RSD为1.06%，表明供试品溶液在120 min 内稳定。

2.1.4 重复性试验 取同一批（BTM-2）药材粉末0.5 g，平行6份，制备供试品溶液，分别取供试品溶液1 mL，置于100 mL容量瓶中，按确定的测定方法测定吸光度，记录供试品溶液的吸光度，计算把天门总黄酮的含量，RSD为0.15%，说明该方法重复性良好。

2.1.5 加样回收率试验 精密称取已知含量的药材（BTM-2）粉末6 份，各0.25 g，分别加入芦丁对照品15.965 0 mg，制备供试品溶液。移取供试品溶液1 mL，置于100 mL 容量瓶中，按确定的测定方法测定吸光度，计算总黄酮含量，结果平均加样回收率为95.29%，RSD为0.65%（表2）。

2.2 化学成分预试验

水提取液检测结果显示，把天门含有糖、多糖、苷类、有机酸、酚类、鞣质类，可能含有皂苷，不含氨基酸、多肽、蛋白质（表3）。乙醇提取液检测结果表明，把天门含有有机酸、酚类、鞣质类、黄酮类、蒽醌类，可能含有强心苷，不含生物碱、植物甾醇、三萜类、内酯、香豆素（表4）。石油醚提取液检测结果显示，把天门不含挥发油及油脂类，结果见表5。

2.3 总黄酮含量测定

取10 批次把天门药材样品，制备供试品溶液，按确定的方法测定供试品溶液的吸光度，计算把天门总黄酮的含量，结果见表6。

3 小结与讨论

化学成分预试验表明，本品可能含有黄酮、糖、多糖、苷类、有机酸、酚类、鞣质、蒽醌等成分类型。总黄酮含量测定试验中比较了直接测定法［9］、硝酸铝比色法和三氯化铝比色法3 种方法。结果表明，硝酸铝比色法中，供试品溶液加入4%氢氧化钠溶液立即出现絮状沉淀，与胡文波等［10］研究时发现的现象相同，且对照品和供试品溶液的最大吸收波长相差甚远；三氯化铝比色法测定时，溶液澄清且稳定性好，供试品溶液与芦丁对照品溶液在275 nm 左右有最大吸收，故选择三氯化铝比色法为总黄酮含量测定的显色方法。考察了三氯化铝显色剂的浓度、用量、显色时间等因素，最终确定显色方法为1%AlCl3乙醇溶液1 mL，加水定容，摇匀，放置20 min；通过单因素及正交试验确定最佳的提取工艺为取把天门样品0.5 g，加70%乙醇20 mL，提取60 min。结果表明，芦丁对照品溶液浓度在0.004～0.040 mg/mL呈良好的线性关系，回归方程为Y=35.142 2X+0.040 645 3（r=0.999 6），10 批把天门药材中总黄酮含量在31.84～75.85 mg/g。试验确定了瑶药材把天门含有的化学成分，为进一步研究其活性成分及开发利用提供了依据。

表2 加样回收率试验结果（n=6）

表3 水提取液预试结果

表4 乙醇提取液预试结果

表5 石油醚提取液预试结果

表6 10 批次把天门药材总黄酮含量测定结果（X±SD，n=3）