NGS检出脑脊液样本中布尼亚病毒1例报道及文献复习

石玉如， 冯 刚， 岳 莉， 谷 妍， 刘 杨， 戚应杰

（1.安徽省立医院感染病院，安徽 合肥 230022；2.安徽省金寨县人民医院，安徽 金寨 237300）

发热伴血小板减少综合征（severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS）是由布尼亚病毒[又称发热伴血小板减少综合症病毒（Severe fever with thrombocytopenia virus，SFTSV）]导致的以发热伴血小板减少为主要临床特征的感染性疾病。在流行区域该病毒感染率为1%～3%，病死率为6%～30%，平均病死率约为10%[1]。该病毒可通过蜱虫、饲养或野生动物、人与人血液或分泌物传播[2]，好发于疫区农民，患者大多住在丘陵或森林地带。该病主要流行于5～7月，5月为发病高峰期。继中国后，韩国、日本、美国等国也有相关报道，SFTSV感染的防治已成为全球性公共卫生问题，不可忽视[3]。本研究采用高通量下一代测序（next-generation sequencing，NGS）技术对1例疑似SFTSV感染重症患者的脑脊液样本进行测序，明确病毒病原体，并结合临床特征及相关实验室检查结果，提高对SFTSV感染重症的认识，同时探讨NGS在脑脊液病原体感染诊断中的价值。

1 病例资料

患者，女，50岁，汉族，安徽安庆地区居民。2018年4月4日采茶时被虫咬伤左髋部，未经特殊处理，随后出现腹泻、头昏、乏力、高热和畏寒症状，最高体温39 ℃。4月6日至当地镇医院检查发现血小板偏低，转至县医院消化科住院，检查发现白细胞和血小板进一步降低，血压降低，4月7日转至市级医院检查发现血小板36×109/L，白细胞2.02×109/L，D-二聚体＞20 μg/mL，丙氨酸氨基转移酶1 034 IU/L，肌钙蛋白24 pg/mL，予以抗感染、保肝、补液扩容等对症处理后，仍有胸闷、气促等症状，4月10日以“发热伴血小板减少”收入安徽省立医院。入院时昏迷状态，体温36.8 ℃，全身多处皮下瘀斑，呼吸急促，双肺少量湿啰音；腹平软，肠鸣音存在。4月11日予以腰椎穿刺进行脑脊液NGS、细菌培养及常规检查，并立即行升压、保护脏器及抗感染等对症治疗，严密监测生命体征，患者仍出现抽搐、意识障碍现象；4月12日上午患者再次出现抽搐，伴有血氧饱和度下降，对症治疗后，抽搐好转；4月13日心电监护提示血压低，心率约110次/min，行气管内插管呼吸机辅助通气过程中，血乳酸明显升高，氧分压低，脑脊液压力极低，积极予以维持血压、抗休克、气管插管呼吸机辅助通气、深静脉置管、扩容、补液等对症支持治疗，白细胞和血小板上升，但仍需大剂量升压药物维持，仍存在意识障碍，偶见自主睁眼。不同时间点的实验室检查结果见表1。

表1 患者不同时间相关实验室检查结果

2 实验室检查

2.1 脑脊液NGS结果

检出SFTSV HB29，检出序列数最多为1 321。检测到SFTSV HB29唯一比对序列数为112条，覆盖度达97.82%，见图1。

图1 SFTSV HB29覆盖度（97.82%）

2.2 SFTSV核酸检测结果

SFTSV核酸检测试剂盒购自上海之江生物公司，以自带标准品（S0=0拷贝/mL、S1=1.0×104拷贝/mL、S2=1.0×105拷贝/mL、S3=1.0×106拷贝/mL、S4=1.0×107拷贝/mL）绘制标准曲线，患者样本检测结果为5.2×108拷贝/mL。见图2。

图2 SFTSV核酸扩增曲线

3 讨论

本病例采用NGS在脑脊液中检出SFTSV，提示此病毒感染可以致脑炎，并成为发生中枢神经系统症状的病因。本病例临床特点包括：（1）在山林地区采茶被虫叮咬后起病；（2）除了在感染初期出现发热伴血小板减少、消化系统反应等症状外，随病情发展，患者陆续出现全身脏器衰竭、意识障碍和抽搐等中枢神经系统感染症状；（3）凝血功能、肝功能和心肌酶等指标异常增高；脑脊液送检结果符合无菌性脑膜炎和病毒性脑膜炎的特点，血压升高，白细胞轻、中度升高，以淋巴细胞为主，脑脊液蛋白升高，糖正常；脑脊液培养阴性；NGS明确SFTSV HB29感染，SFTSV核酸检测结果为5.2×108拷贝/mL；血培养阴性，多项病毒抗体检测阴性；（4）无特效药，一般采取对症治疗；有文献报道体外利巴韦林有抑制病毒的作用[4]，但无体内研究数据证实；（5）重症患者的预后极差。本病例是通过NGS鉴定出SFTSV，同时通过SFTSV核酸检测验证了NGS结果，提示SFTSV感染可以侵袭中枢神经系统，其感染具有较高的致残、致死率[5-6]，应引起临床重视。

SFTSV为一类有包膜的负链RNA病毒[7]，电镜下病毒颗粒呈球形或椭圆形，直径为80～100 nm，其基因组由大、中、小3个单股RNA片段组成[8]。刘秀兰等[9]报道2010—2016年我国基因型的分离株主要为C基因型，C2基因亚型为流行优势株，占分离株的50%以上，该基因型与C3、C4基因亚型和J基因型在我国多个地区交替流行。SFTSV易感性高、起病急，患者主要表现为发热、白细胞下降、血小板减少和消化道症状，重症患者可出现多器官功能衰竭等[10]。

自2009年我国首次发现SFTSV以来，韩国、美国、日本等国也陆续有文献报道。KANEKO等[11]报道1名53岁的日本男子由于高热、腹泻8 d被送入医院，实验室检查结果显示白细胞和血小板减少、肝功能和心肌酶谱持续性上升，被诊断为严重发热伴血小板减少，随后采用逆转录-聚合酶链反应在血液中检测到SFTSV拷贝数为1.46×106拷贝/mL，并且随病情的发展不断上升至1.41×109拷贝/mL，骨髓检查发现吞噬性淋巴细胞增多，同时患者出现意识障碍及类似脑炎症状，患病第13天死亡，尸检结果显示全身（包括中枢神经系统）吞噬性淋巴细胞增多。韩国2013年的全国发热伴血小板减少监测结果显示，有25个地区的35例住院病例为SFTSV感染，其中16例（46%）患者随后死亡，年龄和神经系统症状（包括意识水平下降和言语不清）与患者死亡有关[12]。宋世会等[13]对20例重症SFTSV感染患者进行研究发现，重症患者出现神经系统症状和体征、血小板及白细胞进行性下降、心肌酶谱及血淀粉酶和脂肪酶明显升高、电解质显著异常、白蛋白低下，预后差。因此对SFTSV感染的患者应早发现、早诊断，以及时采取综合治疗措施。

对于SFTSV感染，目前采用的实验室诊断方法主要有病毒分离、病毒核酸检测和血清抗体检测等。病毒分离虽然是金标准，但操作繁琐、技术要求高、耗时长、病毒分离率低，不适用于临床快速诊断；病毒核酸检测主要是针对病毒S、M、L 基因片段的普通逆转录-聚合酶链反应和实时荧光逆转录-聚合酶链反应；血清学抗体检测是应用免疫学原理检测患者血清中相应病毒的抗体，进行初步诊断，可直接观察结果，但特异性不强[15]。

NGS用于中枢系统的SFTSV检测具有优越性。（1）快速检测。传统的病原学检测依赖于培养法，但病原体培养时间普遍较长，且许多病原体不易培养。SFTSV的培养耗时、耗成本，技术含量高，而早诊断、早治疗是提高患者存活率的关键，采用病毒培养的方法无法满足临床需要，快速检测的方法是大势所趋。（2）高通量检测。目前临床病原体检测的常用方法主要为聚合酶链反应和酶联免疫吸附试验，仅可针对某种特定病原体进行检测。在临床表现未能提示特定病原体的情况下，聚合酶链反应和酶联免疫吸附试验均不适用，而NGS可广泛筛查无靶向的病原体。本病例血、脑脊液培养以及各种抗体检测均为阴性，查找不到病原体，采用NGS解决了确定病原体这一难题，使治疗更有针对性。（3）获得更多的病原信息。NGS可以同时获得病原体的具体类型和生物学信息。本病例通过测序确定SFTSV为HB29型，可以了解到更多的病原信息，而这一点是其他方法无法实现的。

总之，对于SFTSV感染的治疗，关键在于早发现、早诊断，以及时确诊并予以对症治疗。若诊断不及时，错过了最佳治疗期，患者极易发展为重症，预后不佳，甚至死亡。因此，及时确定病原体对治愈疾病有着重要的意义。NGS作为新的检测技术，取代常规的脑脊液检测方法，在病原微生物感染的快速诊断中意义重大。