血清HA、HAS2在骨肿瘤辅助诊断及疗效监测中的价值

盛雨梦， 许 静， 刘鷖雯， 何怡青， 刘 华， 黄 宜， 胡嘉捷， 崔 练， 高 锋， 杨翠霞

（1.上海交通大学附属第六人民医院中心实验室，上海 200233；2.上海交通大学附属第六人民医院检验科，上海 200233）

原发性骨肿瘤发生于骨骼或周围血管、神经、骨髓等附属组织，是发病率较高的恶性肿瘤之一。初发骨肿瘤患者主要通过手术治疗，但术后常会遗留微小病灶，导致肿瘤易复发。目前，临床上主要通过影像学方法诊断骨肿瘤，尚缺乏特异性的血清学诊断指标，影响了骨肿瘤的早期诊断和预后评估[1]。透明质酸（hyaluronan，HA）是肿瘤微环境中细胞外基质的主要成分。有研究结果显示，HA在多种肿瘤组织中明显升高，与肿瘤的发生、发展密切相关[2]，但关于血清HA水平与骨肿瘤疾病进展关系的研究较少。透明质酸合成酶（hyaluronan synthetase，HAS）2是合成HA最主要的酶。有研究结果显示，HAS2参与了调控肿瘤转移过程中的上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），可促进肿瘤进展[3]。HA与HAS2无论在功能上还是在促进肿瘤发展方面均有类似的作用，骨肿瘤细胞中HA和HAS2水平均升高[4]。本研究旨在探讨骨肿瘤患者手术前后血清HA、HAS2水平与骨肿瘤的关系，为骨肿瘤的临床诊断及治疗监测提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2020年7—9月上海交通大学附属第六人民医院确诊的骨肿瘤患者35例（骨肿瘤组），其中男2 0例、女1 5例，年龄（40.21±21.35）岁。35例骨肿瘤患者中，骨肉瘤14例、软骨肉瘤14例、骨纤维肉瘤4例、骨巨细胞瘤2例、尤文肉瘤1例；有19例肿瘤＜5 cm，有16例肿瘤＞5 cm；有20例存在骨质破坏，有15例无骨质破坏。所有患者均经病理检查确诊，术前均未进行过放疗或化疗。选取同期上海交通大学附属第六人民医院骨感染性炎症患者40例（骨感染性炎症组），其中男23例、女17例，年龄（49.15±14.91）岁。40例骨感染性炎症患者中，骨髓炎17例、创伤后感染12例、植入物感染11例。另选取同期上海交通大学附属第六人民医院体检健康者60名作为正常对照组，其中男32名、女28名，年龄（39.17±10.37）岁，血压、血脂、血糖、肝功能、肾功能等均正常。本研究经上海交通大学附属第六人民医院伦理委员会批准，所有对象均自愿参加并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 样本收集 采用分离胶促凝管采集骨感染性炎症患者、正常对照者和骨肿瘤患者术前及术后24 h的静脉血2 mL，离心分离血清，置于无菌Eppendorf管，保存于-80 ℃冰箱，统一检测。

1.2.2 血清HA、HAS2水平检测 采用MAGLUMI X8全自动化学发光免疫分析仪（深圳新产业公司）及配套试剂检测HA。采用酶联免疫吸附试验检测HAS2，试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，检测仪器为Epoch酶标仪（美国BioTek公司）。严格按仪器和试剂盒说明书操作。

1.2.3 血清HAS2 mRNA相对表达量检测 采用实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测血清HAS2 mRNA的相对表达量，检测仪器为QuantStudio 7 Flex实时荧光定量PCR仪（美国ThermoFisher Scientific公司）。采用血液RNA提取试剂盒（日本Takara公司）提取血清总RNA，参照逆转录试剂盒（日本Takara公司）说明书将mRNA逆转录为互补DNA（complementary DNA，cDNA），采用实时荧光定量PCR试剂盒（日本Takara公司）进行PCR扩增。反应条件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 5 s，65 ℃34 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃15 s。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt计算HAS2 mRNA的相对表达量。基因序列见表1。

表1 HAS2与β-actin基因序列

1.3 统计学方法

采用SPSS 24.0软件进行统计分析。呈正态分布的数据以±s表示，治疗前、后的比较采用配对t检验，不同组之间比较采用两独立样本t检验。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析各项指标的诊断效能。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨肿瘤组、骨感染性炎症组及正常对照组血清HA、HAS2水平及HAS2 mRNA相对表达量的比较

骨肿瘤组术前、术后血清HA、HAS2水平明显高于正常对照组（P＜0.05），骨肿瘤组术前、术后血清HAS2水平均明显高于骨感染性炎症组（P＜0.05），而血清HA水平与骨感染性炎症组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。骨肿瘤组术后血清HA、HAS2水平均低于术前（P＜0.05）。见表2。

表2 骨肿瘤组、骨感染性炎症组及正常对照组血清HA和HAS2水平的比较

采用实时荧光定量PCR检测了22例骨肿瘤患者、22例骨感染性炎症患者和24名正常对照者血清HAS2 mRNA的相对表达量，结果显示骨肿瘤患者HAS2 mRNA的相对表达量显著高于正常对照者和骨感染性炎症患者，肿瘤病灶切除术后HAS2 mRNA的相对表达量显著降低。见图1。

图1 各组血清HAS2 mRNA表达量比较

2.2 血清HA、HAS2水平及HAS2 mRNA相对表达量诊断骨肿瘤的效能

建立HA、HAS2及HAS2 mRNA联合检测的Logistic回归模型。ROC曲线分析结果显示，以正常对照组为对照，Logistic回归方程为Logit（P）=-13.618+0.204×HA+0.033×HAS2+1.014×HAS2 mRNA。HA、HAS2及HAS2 mRNA单项检测及联合检测模型诊断骨肿瘤的曲线下面积（area under curve，AUC）分别为0.888、0.651、0.747、0.956，敏感性分别为85.7%、40.0%、48.6%、85.7%，特异性分别为80.0%、91.4%、94.2%、91.4%。以骨感染性炎症组为对照，Logistic回归方程为Logit（P）=-3.566+0.016×HA+0.026×HAS2+0.282×HAS2 mRNA。HA、HAS2及HAS2 mRNA单项检测及联合检测模型诊断骨肿瘤的AUC分别为0.485、0.782、0.630、0.789，敏感性分别为25.7%、43.4%、40.0%、80.0%，特异性分别为85.7%、96.7%、82.8%、68.5%。见表3、表4、图2。

图2 血清HA、HAS2水平及HAS2 mRNA相对表达量单项及联合检测诊断骨肿瘤的ROC曲线

表3 以正常对照组为对照时各项指标单项检测及联合检测模型诊断骨肿瘤的效能

表4 以骨感染性炎症组为对照时各项指标单项检测及联合检测模型诊断骨肿瘤的效能

3 讨论

原发性骨肿瘤约占恶性肿瘤总数的1%，该病虽然所占比例小，但是治疗难度大，预后极差，易复发及转移[5]。血清生物标志物作为监测肿瘤进展的敏感方法，在多种肿瘤早期诊断和进展监测中发挥着重要作用[6]。既往关于骨肿瘤进展的研究多集中于细胞外基质中的胶原等标志物，缺乏对其他标志物的挖掘。为了进一步探寻骨肿瘤特有的血清学标志物，本研究同时分析了骨肿瘤细胞外基质中另一种成分——HA以及HA的合成酶HAS2，以寻找更有效的血清学标志物。

HA与多种肿瘤的进展关系密切[7-8]，是肿瘤细胞外基质的主要成分，在肿瘤间质中呈高表达[9]。本研究结果显示，骨肿瘤组和骨感染性炎症组血清HA水平明显高于正常对照组（P＜0.05），而骨肿瘤组与骨感染性炎症组之间差异无统计学意义（P＞0.05），这可能与炎症患者体内的炎性因子诱导HA合成增加有关[10]。本研究结果还显示，骨肿瘤组术后血清HA水平明显低于术前（P＜0.05）。这提示血清HA水平具有监测骨肿瘤疾病进展的潜在价值。HA主要由HAS合成，HAS有3个异构体（HAS1、HAS2、HAS3），其中HAS2是最主要的异构体。在软骨细胞和骨肉瘤细胞中，HAS2的表达量显著高于HAS1和HAS3[11]。有研究结果显示，通过抑制骨肿瘤细胞中HAS2基因的表达，可以明显减少HA的合成[12]。本研究结果显示，骨肿瘤组血清HAS2水平明显高于正常对照组和骨感染性炎症组（P＜0.05），骨肿瘤组术后血清HAS2水平低于术前（P＜0.05），与血清HA水平的变化一致。因此，HA与HAS2联合检测对于骨肿瘤的辅助诊断和疗效监测具有更大的价值。

近年来，肿瘤细胞分泌的外泌体逐渐成为研究热点之一。通过对外泌体中特异的mRNA进行分析，有望找到诊断肿瘤的新型分子标志物[13]。本研究对部分骨肿瘤患者血清HAS2 mRNA的表达量进行了检测，结果显示骨肿瘤组血清HAS2 mRNA相对表达量明显高于正常对照组和骨感染性炎症组（P＜0.05），骨肿瘤组术后HAS2 mRNA相对表达量低于术前，提示血清中游离的HAS2 mRNA可能与骨肿瘤的发生、发展有关，这也为下一步从分子水平上寻找骨肿瘤的特异性标志物提供了理论基础。

本研究还对血清HA、HAS2水平及HAS2 mRNA相对表达量诊断骨肿瘤的价值进行了分析。ROC曲线分析结果显示，血清HA、HAS2水平及HAS2 mRNA相对表达量在骨肿瘤的诊断中均有一定的价值，3项指标联合检测诊断骨肿瘤的效能显著优于单项检测。

综上所述，HA、HAS2及HAS2 mRNA在骨肿瘤的诊断和术后监测中均有一定的价值，但本研究的样本量较小，后续将进一步扩大样本量，以验证本研究得出的结论。