枣幼胚培养畸形苗发生影响因素的研究

任海燕 李登科 王永康 赵爱玲 薛晓芳 弓桂花 李毅

摘 要：以‘冷白玉30 d胚龄的幼胚为材料，对影响胚发育的外源激素、放置方式、胚乳看护时间、光照条件、低温处理的效果进行了研究，以期降低畸形苗发生率，提高幼胚培养效率。结果表明，在IBA0.8 mg/L+ZT0.5 mg/L+GA37.0 mg/L+NAA0.2 mg/L激素条件下，可获得较高的成胚率56.82%;合点端插入培养基的竖放方式可显著促进幼胚生长发育，幼胚萌发率可达77.39%;胚乳看护适宜时间45 d较为适宜;暗培养利于幼胚正常发育;接种前幼果进行低温处理对减缓畸形苗发生的影响较小。

关键词：枣;幼胚;培养

文章编号：2096-8108（2021）01-0011-03 中图分类号：S665.1 文献标识码：A

Abstract：Young embryos （30-day-old） of Chinese jujube （ Ziziphus jujuba‘Lengbaiyu） were selected as materials. The factors influencing the rescue of the young embryos， including hormones， placement， endosperm care time， light conditions and low temperature were studied in order to reduce the incidence of abnormal seeding and increase the young embryo culture efficiency. The culture condition was optimized as follows：， a higher embryo formation rate of 56.82% could be obtained using the hormones of IBA 0.8 mg/L +ZT 0.5 mg/L+GA37.0 mg/L+NAA0.2 mg/L;the germination rate of immature embryos could reach 77.39% by putting the chalazal end of embryo into culture medium （radical end up ）. The appropriate time of endosperm care was 45 days and immature embryos developed normally under the dark condition. 0～4 ℃ low temperature before inoculation had little effect on slowing down the occurrence of deformed seedlings.

Keywords：Chinese jujube;immature embryos;culture

枣胚早期败育问题严重是制约枣杂交育种进程的重大难题，胚培养是克服枣早期败育的有效方法。然而胚培养过程中高频率的畸形苗现象，成为制约该项育种技术开展的主要瓶颈。祁业凤等[1]将枣幼胚接种后，多数形成畸形苗，表现为子叶间小叶不断增生的莲座状。段乃彬等[2]研究發现，发育早期的幼胚经培养后形成卷曲的片状结构，并出现不断增生现象，不能产生根和茎，致使幼胚不能发育为植株。可见畸形苗发生的比例成为影响枣幼胚育种效率的重要因素之一。

Leshem[3]指出畸形苗是生长因子不平衡的产物，适宜的胚挽救条件是预防或减少畸形苗发生率的重要环节。目前，针对无核葡萄胚挽救过程中出现畸形苗的成因和培养条件已做了大量的研究[4，5]，接种前对葡萄幼果进行4 ℃低温处理20 d，可有效减少畸形苗的发生。通过调整激素的种类和浓度来控制葡萄畸形胚的发生取得了明显的效果[6]。同样，研究表明[7，8]，在枣幼胚培养过程中添加适宜的外源激素对幼胚发育有促进作用。关于枣胚培养过程中降低畸形苗发生率的研究鲜有报道。因此，为提高枣幼胚培养效率，预防或减少畸形苗的发生率，我们开展了以‘冷白玉30 d胚龄的幼胚为材料，对影响胚发育的激素、放置方式、胚乳看护时间、光照条件、低温的效果进行了研究，为提高枣幼胚培养效率奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试材‘冷白玉采自山西省农业科学院果树研究所国家枣资源圃。

具体可参照枣定花定果方法[8]。

1.2 试验方法

1.2.1 不同激素配比对幼胚培养的影响

采用L9（34）正交设计，激素IBA0.2～0.8 mg/L、ZT0.5～1.5 mg/L、GA33.0～7.0 mg/L、NAA0.1～0.3 mg/L，研究不同激素配比对幼胚发育的影响，成胚率（%）=可见胚数或胚沿胚性生长数/接种胚数×100%。

1.2.2 不同放置方式对幼胚培养的影响

将每个组合的胚按照完全浸于培养基的平放方式和胚合点端插入培养基的竖放方式进行接种，研究不同放置方式对幼胚萌发的影响。

1.2.3 胚乳看护时间

将枣幼胚接种在相同培养基MS+IBA0.8 mg/L+ZT0.5 mg/L+GA37.0 mg/L+NAA0.2 mg/L+LH 500 mg/L+蔗糖7%中，分别为胚乳看护15 d、30 d、45 d后，研究不同胚乳看护时间对幼胚培养的影响，调查幼胚萌发率。

1.2.4 光照条件

将接种在培养基的幼胚，分别置于光照条件和黑暗条件下进行培养，30 d后调查幼胚发育情况。

1.2.5 低温处理

接种前将幼果进行0～4 ℃低温处理，并设置天数0 d、20 d、40 d、60 d。经低温处理的幼果消毒后在超净工作台上取出幼胚，接种于MS培养基中，附加蔗糖设7%，30 d后调查幼胚发育情况，研究低温处理对幼胚培养的影响。

2 结果与分析

2.1 不同激素配比对幼胚培养的影响

外源激素与内源激素共同作用影响畸形苗的发生，激素因素是影响畸形苗的主要研究内容[10，11]。添加适宜种类和浓度的外源激素，对于胚发育可以起到促进的作用。结果表明，不同激素配比对冷白玉不同胚龄幼胚影响的试验结果表明（表1），幼胚在IBA0.8 mg/L+ZT1.5 mg/L+GA35.0 mg/L+NAA0.1 mg/L时，幼胚获得成胚率最低，仅为38.40%。添加在处理1和处理4的激素条件下，成胚率分别为56.82%、54.51%，显著高于其他处理。可见，IBA0.8 mg/L+ZT0.5 mg/L+GA37.0 mg/L+NAA0.2 mg/L激素条件下，成胚率为56.82%，可以使幼胚沿胚性生长，获得较高的成胚率。

2.2 不同放置方式对胚培养效果的影响

由表2可知，不同放置方式对幼胚萌发率的影响存在显著差异。幼胚平放处理时平均萌发率为34.12%，畸形苗率为36.27%。而竖放时萌发率可达70.54%，畸形苗发生率较低为19.31%。可见，胚珠合点端插入培养基的竖放方式可显著促进幼胚生长发育。这一研究结果与梁春莉等[12]在对冬枣挽救技术中的结果一致。

2.3 胚乳看护培养时间对幼胚发育的影响

由表3可知，30 d胚龄的幼胚经胚乳看护15 d后，多数幼胚肉眼不可见，幼胚发育率调查困难。当幼胚经胚乳看护30 d后，幼胚发育率达59.38%，胚乳逐渐由透明色转为乳白色，幼胚发育为子叶形胚，但幼胚子叶较小，此时转接不易于幼胚沿胚性生长成苗。培养45 d时，虽然发育率为56.82%，但子叶形胚充满种仁的2/3，幼胚发育相对完整，易于幼胚后期萌发成苗。可见，胚乳看护45 d较为适宜，可减少畸形苗的发生，利于幼胚沿胚性生长。

在枣幼胚培养过程中，并非经胚乳看护胚培养获得的全部胚都能正常生长，有的因培养条件不适宜则形成畸形苗。有报道[9]认为，畸形苗的发生可能与胚的发育程度有关。本研究结果表明，幼胚经胚乳看护培养45 d后，多数幼胚发育为子叶形胚，易于幼胚正常发育，有效减少了畸形苗的发生。

2.4 光照条件对枣幼胚发育的影响

结果表明，黑暗条件下幼胚发育率达51.76%;而在光照条件下，幼胚发育率为43.89%，其中部分幼胚出现子叶反卷现象。认为暗培养利于幼胚正常发育，光照条件可诱发幼胚出现早熟萌发，产生畸形苗现象，使幼胚不能沿胚性正常发育。这一研究结果在张曼[13]对枣早期幼胚挽救影响因素研究中得到了证实。

2.5 低温对幼胚发育的影响

由表4可知，接种前幼果进行低温处理对减缓畸形苗发生的影响较小。经不同天数冷处理后，幼胚发育率分别为41.17%（0 d）、42.54%（20 d）、37.53%（40 d）、32.56%（60 d），经冷处理40 d、60 d时，幼果品质变劣，幼胚接种后出现内生菌加重现象，污染率提高，很大程度上影响幼胚萌发率。而崔秀梅等[14]研究认为，枣未成熟且胚龄为60 d以上的胚经0～4 ℃冷藏60 d，可显著提高胚的萌发率和成苗率。这与本研究结果不同，这可能与所选用幼胚的胚龄不同有关。

3 结论

适宜的培养条件能有效减少畸形苗的发生，促进胚正常发育。在IBA0.8 mg/L+ZT0.5 mg/L+GA37.0 mg/L+NAA0.2 mg/L激素条件下，可获得较高的成胚率56.82%;合点端插入培养基的竖放方式可显著促进幼胚生长发育，幼胚萌发率可达77.39%;胚乳看护时间45 d较为适宜;暗培养利于幼胚正常发育;接种前幼果进行低温处理对减缓畸形苗发生的影响较小。

参考文献

[1]祁业凤，刘孟军.枣的胚败育及胚培养研究[J].园艺学报，2004，31（1）：78-80.

[2]段乃彬，王永清.枣树胚离体培养的研究[J].四川林业科技，2002，23（2）：42-45.

[3]Leshem B and Sachs T.Vitrified Dianthus Teratomata in vitro due to growth factor imbalance[J].Ann Bot，1985，56：613-617.

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[12]梁春莉，赵 锦，刘孟军.冬枣极早熟幼胚挽救成苗技术研究[J].园艺学报，2014，41（10）：2115-2124.

[13]张 曼，王玖瑞，刘孟军.枣早期幼胚挽救影响因素研究[C].干果研究进展，2007（3）：173-175.

[14]崔秀梅，王玖瑞，刘孟军，等.枣未成熟胚高效再生体系研究[J].西北林学院学报，2012，27（1）：81-84.