两面针药材质量一致性评价

王 鑫邬国松 牛 明王伽伯赵 昕韩 杰郝亚冬温瑞卿∗李东辉∗

（1.北京市海淀区食品药品安全监控中心，北京 100094；2.解放军总医院第五医学中心全军中医药研究所，北京 100039；3.广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心，广东广州 510006）

两面针为芸香科植物两面针Zanthoxylum nitidum（Roxb.）DC.的干燥根。具有祛风通络、胜湿止痛、消肿解毒的功效，为传统常用中药，主产于广西、广东、福建、云南等地［1］。本实验对广西、广东20 批不同产区的两面针药材结合2020 年版《中国药典》［2］一部的检验项目和HPLC 指纹图谱进行综合评价。检验项目包括性状鉴别、薄层鉴别、薄层检查，水分、灰分、浸出物、氯化两面针碱的含量测定。原药材的安全性、有效性及质量的一致性［3］直接关系到药品的安全、有效，中药材质量的一致性是评价中药材质量的一个重要方面。由于中药材成分复杂，中药指纹图谱［4-7］作为综合的、可量化的色谱鉴别手段，可以较全面的反映中药材的药效学物质特征评价药材的质量，因此选择18 批鉴定为正品的两面针药材建立HPLC 指纹图谱，并进行相似度评价和聚类分析，以期进一步探讨广西、广东不同产地的两面针的质量一致性，为两面针道地药材优良品种质量生物评价研究提供数据支持。

1 材料

1.1 仪器 Waters2695 高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；MSA125P 电子天平（德国赛多利斯公司）；FB15061超声清洗仪（美国Fisher 公司）；硅胶G 薄层版（德国默克公司）；ACY-1002-U 制水机（艾科浦超纯水处理有限公司）。

1.2 试剂与药物 两面针对照药材（批号121014-201204，鉴别／检查用）、氯化两面针碱（批号110848-201604，纯度91.0%）、乙氧基白屈菜红碱（批号110847-200601，供鉴别用）、毛两面针素（批号111531-201603，供检查用），均购于中国食品药品检定研究院。乙腈、甲酸、三乙胺均为色谱纯（美国Fisher Scientific 公司）；甲醇、乙醇、三氯甲烷、浓氨试液、石油醚（60～90 ℃）、硫酸均为分析纯。药材20 批，具体信息见表1。

2 方法与结果

2.1 性状特征 20 批样品中18 批呈厚片或圆柱形短段，长2～20 cm，厚0.5～10 cm。表面淡棕黄色或淡黄色，有鲜黄色或黄褐色类圆形皮孔样斑痕。切面较光滑，皮部淡棕色，木部淡黄色，可见同心性环纹和密集的小孔。质坚硬。样品2 中栓皮碎块较多。样品3、9 表面呈灰棕色，可见疣状突起。

2.2 薄层鉴别及检查

2.2.1 两面针、氯化两面针碱 取样品粉末1 g，加乙醇40 mL 超声处理1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为样品溶液。另取两面针对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。再取氯化两面针碱对照品，加乙醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作为对照品溶液。吸取上述3 种溶液各2 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（30∶10∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外灯（365 nm）下检视。见图1。

表1 样品信息

图1 两面针薄层色谱鉴别（一）

对比薄层图谱，20 份样品与氯化两面针碱对照品在相同的位置上均显相同颜色的荧光斑点，但是样品3、9 可见绿色的荧光带。

2.2.2 乙氧基白屈菜红碱 取乙氧基白屈菜红碱对照品，加乙醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作为对照品溶液。吸取“2.2.1”项下样品溶液、对照药材溶液、对照品溶液各2 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（25∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。见图2。

对比薄层图谱，20 份样品与乙氧基白屈菜红碱对照品在相同的位置上均显相同颜色的荧光斑点，但是样品3、9可见蓝色的荧光带。

图2 两面针薄层色谱鉴别（二）

2.2.3 毛两面针素 取毛两面针素对照品，加乙醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作为对照品溶液。另取样品粉末（过3 号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加70%甲醇20 mL，超声处理（功率200 W，频率59 kHz）30 min，放冷，滤过，滤液置50 mL 量瓶中，滤渣和滤纸再加70%甲醇20 mL，同法超声处理30 min，放冷，滤过，滤液置同一量瓶中，加适量70%甲醇洗涤2 次，洗液并入同一量瓶中，加70%甲醇至刻度，摇匀，取溶液4 mL，浓缩至2 mL，作为样品溶液。吸取上述2 种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以石油醚（60～90 ℃）-三氯甲烷-甲醇（2∶13∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。见图3。

对比薄层图谱，样品3、9 的薄层色谱呈蓝色的荧光条带，且与毛两面针素对照品在相同的位置上显相同颜色的荧光斑点。

图3 两面针薄层色谱检查

2.3 水分、总灰分、浸出物测定 根据2015 年版《中国药典》 四部0832 水分测定法、2201 浸出物测定法、2302灰分测定法，检测20 批样品，结果见表2。药典规定，水分不得超过10.0%，所有样品均符合规定；总灰分不得超过7.0%，所有样品均符合规定；浸出物不得少于5.5%，样品2 小于标准，其他样品均符合规定。

2.4 含量测定

2.4.1 色谱条件及系统适应性试验 DIONEX Acclaim C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.1%甲酸-三乙胺（pH 4.5）（B），梯度洗脱（0～30 min，20%～50% A；30～35 min，50%～100% A）；检测波长273 nm。理论板数按氯化两面针碱计算，应不低于2 500。

表2 样品水分、总灰分、浸出物及含量测定结果（%）

2.4.2 对照品溶液制备 精密称取氯化两面针碱对照品10.37 mg 至20 mL 量瓶中，70%甲醇溶解至刻度，精密量取2 mL 至20 mL 量瓶中，摇匀，制成47.18 μg／mL 溶液。

2.4.3 线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液1、2、4、8、10、12、16、18、20 μL 注入液相色谱仪，记录峰面积。以进样量为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得方程为Y＝593.57X+5.622（r＝0.999 9），在0.047～0.944 μg 范围内线性关系良好。

2.4.4 供试品溶液制备 取样品粉末（过3 号筛）约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加70% 甲醇20 mL，超声处理（功率200 W、频率59 kHz）30 min，放冷，滤过，滤液置于50 mL 量瓶中，滤渣和滤纸再加70%甲醇20 mL，同法超声处理30 min，放冷，滤过，滤液置于同一量瓶中，70%甲醇洗涤2 次，洗液并入同一量瓶中，70% 甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

2.4.5 测定法 精密吸取对照品、供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，色谱图见图4，外标法计算氯化两面针碱含量，结果见表2。

药典规定，按照干燥品计算，氯化两面针碱含量不得少于0.13%，而样品3、9、10、11、12、14 均低于0.13%。

图4 氯化两面针碱HPLC 色谱图

2.5 两面针HPLC 指纹图谱建立

2.5.1 色谱条件 DIONEX Acclaim C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.1% 甲酸-三乙胺（pH 4.5）（B），梯度洗脱（0～30 min，20%～50%A；30～35 min，50%～100%A，36～45 min，80%～20%A）；检测波长273 nm。

2.5.2 对照品、供试品溶液制备 分别按“2.4.2”“2.4.3”项下方法制备。

2.5.3 精密度试验 取供试品溶液（样品18），在“2.5.1”项条件下连续进样测定6 次，采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.1 版本）软件进行相似度评价，结果均≥0.999（RSD＜0.05%），表明仪器精密度良好。

2.5.4 稳定性试验 取供试品溶液（样品18），在“2.5.1”项条件下进样，24 h 内每间隔4 h 测定1 次，记录色谱图，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.1版本）软件进行相似度评价，结果均≥0.997（RSD ＜0.15%），表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5.5 重复性试验 取6 份药材粉末（样品18）各1 g，按“2.5.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.5.1”项条件下进样测定，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.1 版本）软件进行相似度评价，结果均≥0.989（RSD＜0.5%），表明该方法重复性良好。

2.5.6 图谱生成 取18 批经鉴定为正品的药材，按“2.5.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.5.1”项色谱条件下进样测定，记录色谱图。将所有数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.1 版本）软件进行处理，选择S18 号样品色谱为参照指纹图谱。为减小极端数据的影响，选择中位数法作为对照指纹图谱的生产方法，运用手动多点校正方法对色谱峰进行谱图匹配，见图5，建立共有模式。再用相对保留时间标定共有指纹峰，结果确定了15个共有峰，见图6。

图5 18 批两面针药材HPLC 指纹图谱

图6 两面针药材共有模式图谱

2.5.7 两面针指纹图谱评价

2.5.7.1 相似度评价 对18 批已处理的指纹色谱图进行相似度评价，结果见表3，可知相似度范围为0.647～0.993，表明药材质量存在一定的差异；除S12、S20 相似度低于0.85 外，其他样品均大于0.85。

表3 18 批样品相似度（编号和含量测定等的编号保持一致，除去非正品样品3 和9）

2.5.7.2 聚类分析 通过称样量量化，将18 批样品的指纹图谱的共有峰面积进行标准化处理，组成18 阶×15 阶原始数据矩阵，运用iTOL 在线分析软件，选用平均组间连接聚类方法，利用平方欧式距离法作为样品间距计算方法进行系统聚类分析，聚类结果见图7。

18 批两面针药材可分为5 类，S1、S4、S8、S16～S17为Ⅰ类，S2、S6、S10、S18 为Ⅱ类，S5、S7、S11、S13～S15、S19 为Ⅲ类，S12 为Ⅳ类，S20 为Ⅴ类。

图7 18 批样品系统聚类树

3 讨论

性状和薄层色谱鉴别是鉴定中药材真伪的重要手段。对20 批不同产地的两面针样品进行检验和分析。薄层色谱鉴别出样品3、9 均含有毛两面针素，且表皮灰棕色具有疣状突起，性状与飞龙掌血药材一致［8］，推断两者可能为飞龙掌血［8-10］。

中药材的有效成分为植物的次生代谢产物，次生代谢产物的产生与生长环境有密切关系。生态环境条件的不同，可能导致相同品种药用植物次生代谢过程的变化，影响同一品种药材的内在质量［11-12］。本文对不同产区的两面针药材，分别测定了水分、灰分、浸出物及氯化两面针碱的含量。1 批样品的浸出物含量未达到药典标准，4 批样品的含量未达到药典标准，不同产地的两面针药材质量有差异。

由于中药材成分复杂，单一成分的含量不能全面的评价中药材的质量。因此对其他18 批鉴定为两面针的样品建立HPLC 指纹图谱，通过相似度评价和聚类分析进一步探讨比较样品间的整体化学成分的一致程度。相似度评价和聚类分析结果基本一致，因此，以上样品可以分为五类，S12 为一类，S20 为一类，S1、S4、S8、S16～S17 为一类，S2、S6、S10、S18 为一类，S5、S7、S11、S13～S15、S19为一类。由此可见，广东、广西两省之间及产自越南的野生两面针药材均无明显的地域性差异。

S8、S16 为产自广西大新的野生样品，仅采集时间不同，薄层色谱、液相图谱、相似度评价和聚类分析结果显示两种样品的质量具有较高的一致性；S11 和S13 及S14 皆产自广东且聚为一类，其中S11 和S13 同为广东平远县的栽培品种，分析结果显示两种样品的质量也具有较高的一致性；对于整体而言，虽然广东、广西作为两面针药材的道地产地，大部分地区药材的化学成分基本一致，栽培品种和野生品种也无明显差异，但是以上数据显示，来源（栽培／野生和产地）的统一更有利于保证两面针药材的质量一致性。

S11、S12、S13、S14 为不同地区的栽培品种，栽培年限分别为5.5、3、6.5、5 年，其中只有栽培6.5 年的样品其氯化两面针碱的含量高于药典标准。有文献报道氯化两面针的含量与不同的生长期有密切关系［13-14］，提示由于生长年限不足导致了S11、S12、S14 中氯化两面针碱的含量偏低，栽培年限是影响栽培品种质量的重要因素。

综上所述，不同产地来源的两面针存在一定的差异，S1、S4～S8、S13、S15～19，按药典检验符合规定，通过指纹图谱和聚类分析表明这12 批两面针药材质量具有较高的一致性。建立的两面针的HPLC 指纹图谱可有效反映出两面针药材质量的一致性。