基于网络药理学研究通窍活血汤治疗脑梗死后血管性痴呆的作用机制

鄢海良，赵 阳#，方 兴，卓晓贵，郑景辉

（1.广西中医药大学，广西南宁 530001；2.广西中医药大学附属瑞康医院，广西南宁 530001）

血管性痴呆（vascular dementia，VD）是一种因缺血性或者出血性脑卒中而造成的认知、记忆和行为等认知功能障碍的临床综合征。属于中医痴呆、呆病范畴，与风、火、痰、虚、瘀等因素相关［1-2］。西医病因主要由脑血管病（大小动静脉病变、栓塞、小血管病变、脑血管意外、局部和远处的缺血性功能改变等）和危险因素（脑血管病危险因素、卒中、缺血性白质病变等）两个方面。根据流行病学统计［3］，欧美等国家VD 患者占痴呆总患者10%～20%；我国VD 的患病率为1.1%～3.0%，年发病率在5～9／1000人；VD 患者日常生活能力和社会功能严重受损，给家庭和社会带来了沉重的负担。血管性痴呆是可预防和有希望治疗的一种痴呆，起病缓慢，持续进展，可通过早期预防和治疗降低其残障率。西医主要从预防卒中、改善脑循环代谢、神经元保护等方面进行治疗，短期内能改善患者的认知功能障碍，但不能从根本上阻止神经细胞的继发性凋亡和坏死［4］。从传统中医中药的整体辨证和治未病出发，发挥中医中药的多成分多靶点的辨证施治、未病先防既病防变作用，以期早期干预及延缓甚至阻止痴呆的发生。通窍活血汤出自清代著名医家王清任的《医林改错》，具有活血祛瘀、通络止痛、开窍醒神的功效，原文：立通窍活血汤，治头面，四肢，周身血管血瘀之证［5］。现代研究表明通窍活血汤具有抗脑血栓形成、减轻脑水肿、抑制脂质过氧化反应、减轻自由基对脑组织损伤、改善脑缺血后脑组织损伤、减少神经元丢失率，改善神经可塑性和突触重构，改善VD 大鼠学习记忆能力［6-7］。当前大多数研究主要是通过临床疗效观察和动物实验来探讨通窍活血汤作用于血管性痴呆的作用机制及疗效，尚未阐述具体化合物靶点与疾病靶点的相互作用机制，而网络药理学是通过构建“药物-靶点-疾病”网络来更系统综合地观察药物对疾病网络的干预机制，利用中药复方为多成分、多靶点的协同作用机制，在分子水平上阐明、成分和靶点药物靶点、疾病靶点及药物疾病共同靶点网络之间的协同效应和潜在机制。

1 方法

1.1 通窍活血汤化合物的收集筛选、靶点预测 通窍活血汤由8 味药材组成，分别是赤芍、川芎、桃仁、大枣、红花、葱白、生姜、麝香，通过文献调研和中药系统药理学数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）收集其所含化合物，并以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug likeness，DL）≥0.18 为限定条件对所收集到的化合物进行筛选［8］，将筛选出的有效化合物在TCMSP 中自带的Related Targets 完成有效化合物作用靶点预测。

利用生物信息学分析工具（http：／ ／bionet.ncpsb.org／batman-tcm／，BATMAN-TCM），以化合物相关度得分（score cutoff）≥100、假定值P≥0.05 为限定条件对通窍活血汤有效化合物成分进行筛选及药物作用靶点预测。为了使数据格式的整体一致，运用有机小分子生物活性数据库（https：／ ／www.ncbi.nlm.nih.gov／pccompound／，Pub-Chem）对筛选出的两组有效化合物进行统一ID 编码。

1.2 通窍活血汤作用靶点基因名的校正、筛选 将“1.1”项下通窍活血汤有效化合物靶点导入STRING10.5数据库（https：／ ／string-db.org），限定研究物种为人类，同时剔除非人源靶点，校正为其官方名称并摘录其标准基因名；BATMAN-TCM 筛选出的靶点即标准基因名，无需校正。将2 组通窍活血汤的靶点基因名导入VENNY2.1（http：／ ／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／index.html），剔除重复靶点后，即为通窍活血汤有效化合物作用靶点的基因名。

1.3 血管性痴呆疾病相关靶点的检索、筛选 将“血管性痴呆”作为检索词，文献查询其英文名为“Vascular dementia”，通过GeneCards 数据库（https：／ ／www.genecards.org／）、OMIM 数据库（https：／ ／www.ncbi.nlm.nih.gov／omim／）检索血管性痴呆发病相关靶点。GeneCards 数据库通过Gifts 算法，能够计算靶点与疾病的相关度，并按照相关度排序。按照靶点与血管性痴呆的相关程度，为减少冗余，选择相关度得分≥15 的靶点作为血管性痴呆靶点进行研究，并摘录相应的靶点的标准基因名。最后将这两个数据库检索到的血管性痴呆疾病相关靶点导入VENNY2.1（http：／ ／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／index.html），得到两组数据的共同靶点，即血管性痴呆疾病的靶点。

1.4 通窍活血汤对血管性痴呆作用靶点的预测 将“1.2”项下预测的通窍活血汤化合物作用靶点与“1.3”项下筛选的血管性痴呆相关发病靶点导入VENNY2.1（http：／ ／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／index.html），得到2 组靶点的共同靶点，即为通窍活血汤作用于血管性痴呆的靶点。将每个靶点与每个对其有药理作用的化合物相对应，采用Cytoscape3.6.1 软件绘制化合物-靶点图。

1.5 通窍活血汤对血管性痴呆作用靶点的PPI 网络构建将“1.4”项下预测的通窍活血汤作用血管性痴呆的靶点上传至STRING10.5 数据库（https：／ ／string-db.org），选择研究物种为人类，设置靶点之间最低联系分数为0.4，并隐藏不与其他靶点联系的靶点，获得通窍活血汤对血管性痴呆靶点之间联系网络图，导入Cytoscape3.6.1 软件进行拓扑学分析，并构建PPI 网络。

1.6 通窍活血汤对血管性痴呆作用靶点的富集分析和通路注释分析 把通窍活血汤对血管性痴呆作用靶点导入DAVID Bioinformatics Resources 6.8 数据库（https：／ ／david.ncifcrf.gov／summary.jsp），选择生物过程（biological process）、分子功能（molecular function）、细胞成分（cellular component）对通窍活血汤作用于血管性痴呆的靶点进行基因本体（GO）富集分析，通过KEGG 进行靶点基因通路注释分析。采用GraphPad Prism 7 软件将GO 富集分析满足假定值P＜0.05 的结果做成可视化条形图，Omicshare（http：／ ／www.omicshare.com ／）、HemI 将得到的KEGG 靶点基因通路注释分析满足假定值P＜0.05 的结果分别制成可视化气泡图、聚类图。

1.7 通窍活血汤主要有效化合物与其作用的血管性痴呆靶点分子对接 利用RCSB PDB 数据库（https：／ ／www.rcsb.org／）查找通窍活血汤作用的血管性痴呆靶点的PDB ID，将mol2 格式的化合物与PDB ID 形式的靶点上传至Systems Dock Web Site 数据库（http：／ ／systemsdock.unit.oist.jp／iddp／home／index）进行分子对接，通过所得的Docking Score 值分析对接分子与靶点之间的结合活性。一般认为对接分数（docking score）值＞4.25 表示对接分子与靶点之间有一定的结合活性，＞5.0 表明对接分子与靶点之间有较好的结合活性，＞7.0 则说明具有强烈的结合活性。

2 结果

2.1 通窍活血汤化合物的收集筛选、靶点预测 通窍活血汤有效化合物共165 个，其中赤芍25 个，川芎25 个，葱白7 个，红花26 个，大枣35 个，麝香5 个，桃仁22 个，生姜20 个，具体见表 1；有效化合物作用靶点2 203 个，其中TCMSP 数据库收集到1 389 个，BATMAN-TCM 收集到814 个。

2.2 通窍活血汤作用靶点基因名的校正、筛选 通窍活血汤标准基因名共2 170 个，其中TCMSP 数据库1 247 个，BATMAN-TCM 数据库814 个，删除重复靶点后得493 个。

2.3 血管性痴呆发病靶点收集 GeneCards 数据库共检索出2 966 个与血管性痴呆发病相关的靶点，相关度最高的是Vascular Endothelial Growth Factor A（95.7 分），最低的是Zinc Finger And AT-Hook Domain Containing 类靶点（0.2分），其中相关度得分≥15 的靶点共194 个，而OMIM 数据库共检索到1 047 个血管性痴呆发病的靶点，导入VENNY2.1（http：／ ／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／index.html）中后得到2 个数据库的共同靶点109 个，即为血管性痴呆发病的靶点。

2.4 通窍活血汤作用血管性痴呆靶点的预测 分别将“2.2”“2.3”项下靶点、基因名导入VENNY2.1 软件，共得到33 个共同靶点，包括AKT1、CCL2、CRP、F3、HIF1A、HMOX1、ICAM1、IFNG、IL1B、IL6、KDR、MAPK8、MMP2、MMP9、MPO、NOS3、PLAT、PLAU、PON1、PPARG、PTGS2、SELE、SERPINE1、SLC6A4、TGFB1、THBD、TP53、VCAM1、VEGFA、BCHE、NOS1、MTHFR、LPL，即为通窍活血汤作用于血管性痴呆的靶点，见图1。将其与相对应的化合物进行联系分析，共得到123对相关的联系，通过Cytoscape3.6.1 软件进行拓扑学分析，得到作用靶点数排名前6 的化合物为槲皮苷（26 个）、木樨草素（10 个）、山柰酚（8 个）、黄芩素（7 个）、β-胡萝卜素（6 个）、β-谷甾醇（4 个），化合物-靶点联系图见图2。

表1 通窍活血汤有效化合物

续表1

图1 通窍活血汤作用血管性痴呆靶点的预测图

2.5 通窍活血汤对血管性痴呆作用靶点的PPI 网络 通过STRING10.5 数据库分析得到33 个靶点之间340 条联系的网络图，导入Cytoscape3.6.1 软件进行拓扑学分析，发现靶点之间联系个数排名前十的靶点为IL6（32 个）、NOS3（30 个）、SERPINE1（29 个）、IL1B（28 个）、CCL2（28个）、CRP（28 个）、VEGFA（27 个）、AKT1（26 个）、MMP9（26 个）、MMP2（25 个）、PTGS2（25 个）、ICAM1（25 个）、VCAM1（25 个），PPI 网络图见图3。

2.6 通窍活血汤对血管性痴呆作用靶点的GO 富集分析和通路注释分析 GO 富集分析生物过程、分子功能、细胞成分分别得到69、23、16 个条目，各取前15 个条目绘制可视化条形图，见图4。其中，生物过程与血管性痴呆相关的包括缺氧反应、基因表达的正调控、血管生成的正调控、一氧化氮生物合成过程的正向调控、细胞对缺氧的反应、内皮细胞增殖的正向调控、钙离子转运的负调控、蛋白质磷酸化的正调控、炎症反应，分子功能与血管性痴呆相关的包括血红素结合、细胞因子活性、一氧化氮合酶活性，细胞成分与血管性痴呆相关的包括血小板阿尔法颗粒腔、蛋白质的细胞外基质、血液微粒、蛋白质复合体。通路注释分析得到P≥0.05 的通路有49 条，前20 条通路中共涉及26 个靶点，与血管性痴呆相关的包括肿瘤坏死因子信号通路、缺氧诱导因子-1 信号通路、血管内皮生长因子信号通路、补体和凝血级联、核因子κB 信号通路，可视化气泡图见图5，聚类热图见图6。

图2 通窍活血汤有效化合物作用血管性痴呆靶点网络图

图3 通窍活血汤对血管性痴呆作用靶点的PPI 网络图

2.7 通窍活血汤主要有效化合物与其作用的血管性痴呆靶点分子对接 根据“2.4”项下拓扑学分析结果，选择排名前四的槲皮苷（5280343）、木樨草素（5280445）、山柰酚（5280863）、黄芩素（5281605）作为主要有效化合物，与通窍活血汤作用的33 个血管性痴呆靶点进行分子对接。结果，51 组对接中Docking Score 值＞7 的有3 组，＞6 的有34 组，＞5 的有40 组，＞4.5 的有44 组，测不出的有7 组，具体见表2。

3 讨论

图4 通窍活血汤对血管性痴呆作用靶点的GO 富集分析

图5 通窍活血汤对血管性痴呆作用靶点的KEGG通路注释分析

表2 通窍活血汤主要有效化合物与其作用的血管性痴呆靶点分子对接结果

血管性痴呆是以认知、记忆等诸多功能障碍为主，而且可能伴有语言、人格或情感障碍的一种获得性智能持续性损害疾病，而脑血管病变导致局部或全脑缺血、缺氧、细胞坏死，继而引起脑部与认知、记忆等相关的特定神经组织损害是血管性痴呆发病的主要病理过程，其发病机制、生物学标志物、早期预防、后期治疗是血管性痴呆研究领域中的重点和热点。中药是一种具有多种生物活性的多组分复杂体系，在干预疾病过程中体现出复方制剂多成分、多靶点、多通路整合调节的作用特点，故采用网络药理学构建疾病与药物多通路、多靶点复杂的机制，系统研究药物疾病靶点作用机制及发现潜在靶点，既可系统阐述与疾病相关作用机制，又可为潜在靶点及机制的研究提供新思路。

图6 通窍活血汤对血管性痴呆作用靶点的KEGG 分析聚类热图

结果，通窍活血汤中有165 个有效化合物，33 个药物疾病共同靶点共有198 对药理作用。现代研究表明，大枣具有增强免疫功能、抑制癌细胞增殖、降血压、降胆固醇、抗氧化作用［9］，红花具有保护脑组织、抗血小板聚集、增强抗应激能力、降低血液黏度、降低血压、调节血脂平衡等作用［10］，桃仁具有免疫调节、抗氧化、抗炎、心血管保护、抗肿瘤作用［11］，赤芍具有抗血栓、抗氧化、抗内毒素、抗肿瘤、保护神经作用［12］，生姜具有改善脑组织能量代谢、清除氧自由基、抑制钙超载、抑制神经细胞凋亡作用［13］，葱白具有抑制炎症细胞因子［14］；麝香具有抗炎、兴奋中枢、苏醒作用。Quercetin（槲皮苷）为大枣、红花共有成分，经口服后在肠道细菌的作用下分解为槲皮素和糖类；槲皮素经肠上皮细胞吸收，发挥抗氧化、治疗心血管疾病、抗炎、抗脑损伤中药［15-16］。beta-sitosterol（β-谷甾醇）为桃仁、赤芍、大枣、红花、生姜共有成分，具有抗氧化、降低胆固醇、抗焦虑、抗惊厥、抑制炎性因子分泌［17］。baicalein（黄芩素）为红花、赤芍共有成分，是神经元细胞中的有效自噬诱导剂，通过抑制mTOR 途径诱导神经元细胞自噬，促进α-syn 在神经元细胞中的降解，并拮抗α-syn 对神经细胞的毒性损伤以达到神经保护的目的［18］；β-carotene（β-胡萝卜素）是天然的抗氧剂，可通过减轻eNOS 脱偶联和硝化应激损伤，发挥抗缺血性脑损伤作用［19］；luteolin（毛地黄黄酮）为红花成分，能通过提高因脑缺血再灌注损伤引起的SOD、GSH-Px、CAT 活性下降，降低升高的MDA 水平，进而发挥抗脑缺血再灌注脑损伤作用［20］。

对通窍活血汤作用于血管性痴呆的33 个共同靶点进行拓扑、聚类分析，发现靶点之间作用与被作用的复杂关系，并重点分析靶点之间联系排名前十的靶点，初步揭示药物疾病共同靶点的作用机制。IL6、IL1β、ICAM1、VCAM1 是炎症因子，CRP 是炎症特异性反应，血管内皮细胞损伤引起血管病变继发脑缺血，缺血中心区神经元释放相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）激活免疫应答，而后星形胶质细胞和小胶质细胞活化释放TNFα，IL-1β，IL-6 等一系列炎症因子，使得血管内皮细胞ICAM-1、血管内皮细胞黏附分子VCAM1 表达上调，引发细胞炎症反应，使神经元发生不可逆死亡［21］。NO 是一种血管、神经活性物质，具有调节脑血流、抑制或促进神经递质释放、兴奋神经元、引发炎症、学习记忆功能。脑缺血缺氧以后，兴奋性氨基酸增加激动NMDA 受体，灰质氧化和线粒体损伤、细胞内钙超载，激活NOS 释放大量对脑神经有害的NO，介导迟发性神经死亡，谷氨酸过度释放，引起海马区信号传递释放障碍，继而引起学习障碍；抑制神经胶质细胞NOS3 的生成可以防止轴突线粒体分裂，恢复线粒体活力，维持Miro-2 水平来保护轴突，进而保护脑损害［22-23］。CCL2 是人体内细胞趋化因子，介导单核细胞迁移；在脑缺血缺氧的情况下，氧化应激、细胞因子或者生长因子的刺激等的介导，其表达水平会显著升高，然后损伤内皮细胞的紧密连接和破坏血脑屏障，增加免疫细胞的募集以加重炎症反应，活化小胶质细胞，兴奋多巴胺神经元，通过抑制CCL2 的表达可以减轻脑缺血后的炎症反应及神经元损害［24］；同时CC 趋化因子受体（CCR2）是通过与CC 趋化因子配体（CCL2）结合发挥作用的，CCR2受体细胞在CCL2 的诱导迁移至炎症部位，分化巨噬细胞，释放炎症因子，发挥吞噬功能；CCR2 神经祖细胞在CCL2的介导下被吸引至神经损伤处并分化成神经元，以发挥神经再生功能［25］。VEGFA 是通过与VEGFR2 结合激活两条信号通路而发挥作用：第一，激活Src 信号通路后，导致内皮细胞上α6β1 整合素与其配体分离，进一步激活金属基质蛋白酶（MMPs，主要是MMP2、MMP9），降解细胞外基质，促进内皮细胞的迁移；第二，激活经典的PI3／AKT 信号通路，释放钙离子、PKC 等第二信使促进内皮细胞活化、分裂、增殖，促进血管新生［26］。PTGS2 是前列腺素内源性过氧化物合酶PTGS 的2 个异构酶，PTGS 及其产物参与血压调节、炎症反应、凝血平衡、肿瘤新生等多种生理病理过程［27］。SERPINE1 基因多态性与aSAH 后迟发性脑缺血和功能预后有关。这些关联可能来自纤溶酶原激活物抑制剂1 水平的改变［28］。

对通窍活血汤作用血管性痴呆的33 个靶点进行GO 富集分析以及上述重要靶点分析，在生物过程方面，排名前十五的条目中，angiogenesis（血管生成）、positive regulation of nitric oxide biosynthetic process（一氧化氮生物合成过程）、cellular response to hypoxia（细胞对缺氧的反应）、positive regulation of endothelial cell proliferation（血管内皮细胞增值的正向调控）、positive regulation of protein phosphorylation（蛋白质磷酸化的正调控）、inflammatory response（炎症反应）、negative regulation of calcium ion transport（钙离子转运的负调控）

主要表现为脑损伤缺血缺氧后，发生应激免疫反应，一氧化氮合成、血管内皮再生、蛋白质受蛋白酶分解继发内源化炎症反应的级联生物过程；分子功能方面，排名前15 的条目中，heme binding（血红素结合）功能使血液中多余的游离血红素与血红素结合蛋白相结合后清除，防止游离血红素导致氧化应激反应对血管系统造成损伤并加重炎症反应［29-30］；serine-type endopeptidase activity（细胞因子活性）如TNF-α、IL-1β，IL-6 等炎性细胞因子的表达，是脑组织细胞损伤的表现也是进一步发展的加重机制。nitricoxide synthase activity（一氧化氮合酶活性），脑缺血缺氧，兴奋性氨基酸增加激动NMDA 受体，细胞内钙超载，激活NOS 释放大量对脑神经有害的NO，最终造成血管内皮的损害，缺血区域脑组织支配相应功能的缺失［31］。细胞成分方面，排名前15 的条目中，platelet alpha granule lumen（血小板alpha 颗粒腔），血小板通过释放血小板alpha 颗粒内容物促进血管内皮的修复，而血管内皮的损伤能够引起血栓、血管炎、出血、动脉粥样硬化等；proteinaceous extracellular matrix（蛋白质性细胞外基质）则与粥样斑块的稳定性密切相关；extracellular matrix（细胞外基质）通过MMP9 介导分解细胞外基质，导致缺血再灌注后血脑屏障损伤，通过抑制MMP9 激活可改善血脑屏障通透性［32］；blood microparticle（血液微粒）如IL-6、VEGFA、MMP9 等微粒直接或间接与脑组织损害相关。通过拓扑分析及GO富集分析表明通窍活血汤对脑梗后血管性痴呆的多通路、靶点的作用机制，治疗机制及靶点的多样性。

经KEGG 及聚类分析得出与血管性痴呆相关关系较为密切的5 条通路，分别为TNF signaling pathway（肿瘤坏死因子信号通路）：由VCAM1，AKT1，ICAM1，IL-6，CCL2，PTGS2，MMP9，IL-1β 等主要靶点构成，肿瘤坏死因子可以诱导白细胞介素等促炎细胞因子，从而引起炎症反及损伤血管内皮细胞［33］；HIF-1 signaling pathway（缺氧诱导因子-1 信号通路）：由AKT1，IL-6，HIF1A，HMOX1，VEGFA，SERPINE1，IFNG，NOS3 靶点构成的通路；缺氧时，线粒体呼吸链电子传递及氧化磷酸化发生障碍，进而导致电子传递链上酶活性抑制、氧化磷酸化水平降低，ATP 合成减少、自由基产生增多，突触减少，神经传导速度下降，神经元坏死或凋亡而出现临床认知功能下降表现，HIF-1 能改善脑组织缺血，减少组织再灌注损伤，改善局部能量代谢障碍，促进血流动力学恢复和新生血管生成，维持神经细胞生存微环境的稳定［34-35］；VEGF signaling pathway（血管内皮生长因子信号通路）：由AKT1，PTGS2，VEGFA，NOS3 靶点构成，VEGF 及其受体能诱导血管新生及神经发生、促进神经功能的恢复［36］；Complement and coagulation cascades（补体和凝血级联）：由PLAT，THBD，F3，SERPINE1，PLAU 靶点构成；与凝血关系密切；NF-kappa B signaling pathway（NF-kappa B 信号通路）：NF-kB 通路由VCAM1，ICAM1，PTGS2，IL-1β 靶点构成；通过诱导细胞增殖分化、介导细胞炎性免疫和诱导细胞凋亡从而发挥基因转录的生物学效应；研究表明，川芎、红花、赤芍、大枣、桃仁、生姜、葱白、麝香的有效化合物通过诱导SERPINE1、VEGFA、PTGS2、COX-2、TNF-α、IL-6、IL-1β、AKT1 等靶点，启动TNF signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、VEGF signaling pathway、Complement and coagulation cascades、NF-kappa B signaling pathway 等通路而发挥对血管性痴呆治疗机制及靶点的多样性，如抗炎、抗氧化、钙通道的调节、血脑屏障保护、调节脑血流、稳定斑块、抑制或促进神经递质释放、促进神经元再生等；本研究选取NF-kappa B signaling pathway 阐述其通路机制，见图7，脑组织损伤后可出现不同程度的神经细胞损伤，而成人神经干细胞（NSCs）属于休眠状态，在病理及外因的刺激下可激活，表现出再生及修复能力，促进神经干细胞再生，其中NF-κB 是诱导细胞增殖分化、免疫、凋亡的关键性转录因子；NF-kappa B 信号通路由NF-κB、NF-κB 抑制蛋白（Iκβ）、Iκβ 激酶复合物（IKKs）和其上游激酶组成。脑缺血后，蛋白激酶级联反应被激活，Iκβ 磷酸化，随之被蛋白酶体快速降解，NF-κB 被激活，进入细胞核，启动靶基因的转录，诱导与免疫、炎性反应和凋亡，激活局部内皮细胞和白细胞表面黏附分子的释放数量及功能的上调，造成局部血管的堵塞。研究表明通过干预使Iκβα 表达增加、p-NFκB、p-p65 的表达减少，从而达到抑制NF-κB 信号通路中炎性介质反应起到脑保护作用［37］。

图7 NF-κB 信号通路流程图

综上所述，本研究通过网络药理学对通窍活血汤作用于血管性痴呆的机制进行研究，分别从药物疾病靶点预测筛选、PPI 分析、GO 富集、KEGG 通路、聚类进行分析，进而预测通窍活血汤通过如抗炎、抗氧化、钙通道的调节、血脑屏障保护、调节脑血流、稳定斑块、促进血管再生、抑制或促进神经递质释放、促进神经元再生等机制发挥脑保护作用，最后通过分子对接，验证了通窍活血汤有效化合物与其作用的靶点结合活性较好，建立在此基础上的靶点预测具有较高的可信度，进而证明本研究预测的真实性。