基于网络药理学研究升陷汤治疗心力衰竭的作用机制

王明珠，符德玉，姚 磊，桂明泰，卢 波，李建华

（1.上海中医药大学，上海 201203；2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院心血管研究室、 心内科，上海 200437）

心力衰竭是由于心脏结构或功能异常导致心室充盈或射血能力受损的复杂临床综合征，为各种心脏疾病的严重表现或晚期阶段［1］，主要表现为呼吸困难、疲乏、液体潴留，包括肺瘀血、体循环瘀血、外周水肿等［2］，在发达国家其死亡率为1.5%～2.0%，70 岁以上的人群患病率≥10%［3］，而在我国住院患者病死率约为4.1%［4］。原发性心肌损害和异常是心力衰竭最主要的病因，并且除了心血管疾病外，非心血管疾病也可导致其发生，目前它是一种慢性、自发进展性疾病［5］。2018 年中国心力衰竭诊断和治疗指南提出，神经内分泌系统激活导致心肌重构是引起心力衰竭发生发展的关键因素，推荐尽早使用沙库巴曲缬沙坦类药物，以进一步减少其发病率及死亡率［6］。

中医认为，心气是心脏功能活动的原动力，“心气不足”是心力衰竭发生的病理基础及其转归预后的决定因素［7］。心力衰竭总属本虚标实之证，以心气不足、心阳虚衰为本，血脉瘀滞、水饮内停、痰浊不化为标，益气、活血、利水为治疗大法［8］。

升陷汤出自《医学衷中参西录》，主治胸中大气下陷，方剂药味简单，量大功专［9］。方中重用黄芪六钱甚达数两，以其补气升阳重用为君药；柴胡、升麻共用以升阳举陷，前者引下陷之大气自左而升，后者引下陷之大气自右而升，同为臣药；知母清热凉润，可缓黄芪之温燥，为佐药；桔梗为舟楫，载诸药上达于胸中，为使药，诸药配伍，共奏补气、升阳、举陷之功效［10］，主治“胸中大气下陷，气短不足以息，或努力呼吸，有似乎喘；或气息将停，危在顷刻。其兼证，或寒热往来，或咽干作渴，或胸闷怔忡，或神昏健忘”［11］。张锡纯提出“大气下陷”理论，即胸中气陷、行血乏力，与现代医学对血液循环心脏泵血功能衰竭的认识一致，可认为是中医“心衰病”之主要病机之一［12］，他所创的升陷汤、回阳升陷汤等方剂了可灵活运用于心力衰竭的治疗，随证加减，往往取得较好的临床疗效［13］。

中药及其复方具有多成分、低选择性、多靶点相互作用的特点，这种复杂性使其质量难以控制，缺乏合理有效的安全评价体系，对其作用、配伍机制的分析也相对困难［14-15］。近年来网络药理学在国际上兴起，它具有多方向交叉融合的特点，可实现对中药及其复方的综合网络分析，从系统层次了解疾病的发生机制，其研究策略的整体性、系统性与中医整体观念、辨证论治不谋而合，在识别中药及其复方活性成分及作用靶点、阐明作用机制、解释组方规律具有重要的优势及潜力［16-17］。因此，本研究采用网络药理学分析升陷汤治疗心力衰竭的药效物质基础和分子机制，建立“药效成分-靶标-通路”关系网络，探究该方多成分、多靶点、多途径作用机制，为其基础实验研究和临床合理应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 成分虚拟筛选 本研究通过中药系统药理数据（TCMSP，http：／ ／ibts.hkbu.edu.hk／LSP／Tcmsp.Php）、台湾中医药资料库（TCM Database，http：／ ／tcm.cmu.edu.tw／zh-tw）检索升陷汤所有化学成分，将其进行筛选，化合物口服生物利用度（OB）筛选阈值均≥30%，化合物类药性（DL）筛选阈值均≥0.18。

1.2 候选化合物靶点预测 通过中药系统药理数据库（TCMSP，http：／ ／ibts.hkbu.edu.hk／LSP／tcmsp.php）检索候选化合物靶点，并通过Uniprot 数据库（http：／ ／www.uniprot.org／）将预测出的靶点蛋白名转换为基因名。

1.3 化合物-靶点网络和靶点-疾病网络的构建 通过Genecards 数据库（https：／ ／www.genecards.org／）与OMIM数据库（https：／ ／www.genecards.org／）检索与心力衰竭相关的基因，通过R 软件将化合物、心力衰竭靶点进行统计分析，获得药物-靶点网络，并且绘制药物靶点韦恩图，存在交集的蛋白质即有可能是升陷汤活性成分治疗心力衰竭的靶点。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建 将药物靶点和疾病靶点基因，从STRING 数据库（http：／ ／stringdb.org）中绘制PPI 网络，获得蛋白互作CSV 文件，通过R 软件进行基因关联度分析，并获得关联度排名前30 的基因。再采用Cytoscape3.7.1 软件，将靶点基因、药物组成进行网络拓扑分析，进一步筛选升陷汤干预心力衰竭的潜在药物、基因靶点。

1.5 基因富集分析 通过R 软件ClusterProfile 程序包（http：／ ／bioconductor.org／biocLite.R）对筛选出的基因进行GO 功能、KEGG 通路富集分析，获得柱状图、富集图相关通路图，以进一步阐明升陷汤的潜在靶点在基因功能和信号通路中的作用。

2 结果

2.1 升陷汤活性成分筛选 共检索出806 种成分，其中柴胡349 种，黄芪87 种，桔梗102 种，升麻187 种，知母81种。以OB≥30%、DL≥0.18 为标准，共筛选出76 种作为候选化合物。具体见表1。

表1 升陷汤中生物利用度较高的化合物

2.2 药物靶点与疾病靶点的交集预测 将药物靶点与心力衰竭疾病基因靶点通过R 语言进行统计分析，获得升陷汤药物成分-心力衰竭靶点基因交集，并绘制药物靶点韦恩图，见图1。共获得药物-疾病交集基因197 个，可认为是升陷汤干预心力衰竭的潜在基因靶点，具体见表2。

2.3 蛋白靶点PPI 网络构建 通过STRING 蛋白数据库获取靶点蛋白的相互作用，并根据其基因相互结合度进行数据显示统计，结果见图2。再筛选出蛋白相互作用度＞60 的基因，绘制柱状图，发现排名前20 的作用靶点为AKT1、IL6、VEGFA、CASP3、JUN、MAPK1、EGFR、MAPK8、MYC、PTGS2、EGF、CXCL8、MMP9、FOS、ESR1、IL1B、CCND1、CAT、CCL2、ERBB2，它们是升陷汤干预心力衰竭可能性最大的基因靶点，具体见图3。

图1 药物靶点与疾病靶点的韦恩图

表2 升陷汤与心衰靶点疾病交集基因

进一步缩小范围，将基因关联度排名最靠前的AKT1、IL6、VEGFA 基因单独绘制蛋白靶点，以更加明确地展示其相互作用机制，并更直观地展示升陷汤干预心力衰竭最有可能的潜在靶点，具体见图4。

2.4 基因-化合物-疾病靶点互作图 采用Cytoscape3.7.1软件，将升陷汤组成成分、交集靶点基因进行网络拓扑分析，绘制可视化的相互作用图，结果见图3。升陷汤中发挥主要作用的成分有32 种，其中黄芪11 种，升麻8 种，知母5 种，柴胡4 种，桔梗4 种，主要包括黄芪异黄烷苷、黄芪糖苷类、知母皂苷类、升麻萜类、桔梗苷甲酯等化合物，具体见图5。再提取排名最靠前的3 个基因靶点AKT1、IL-6、VEGFA，构建互作图，筛选出5 种成分，分别为薯蓣皂苷、莰非醇、木犀草素、芍药苷、槲皮素，对其作进一步分析，结果见图6。

图2 药物-疾病靶点蛋白作用网络

图3 药物靶点与疾病靶点的交集基因柱状图

图4 排名前3 名基因的相互作用图

2.5 GO 富集分析 通过R 语言软件中的ClusterProfiler GO 对升陷汤成分-靶点-疾病网络所涉及的197 个蛋白质功能进行富集分析，确定了182 个GO 条目（P＜0.05），并对其进行分析，列出前20 条主要生物过程，进行柱状图统计，主要包括转录因子活性、辅因子结合、细胞因子受体结合、受体配体活性、酰胺结合、蛋白丝氨酸／苏氨酸激酶活性、细胞因子活性等，具体见图7。

图5 升陷汤药物组成-心力衰竭靶点相互作用网络

图6 AKT1、IL-6、VEGFA 基因-化合物-疾病互作图

图7 GO 条目柱状图

另外，主要涉及“细胞组成”的有转录因子激活、细胞因子受体结合、酰胺及多肽结合、G 蛋白偶联胺受体活性、类固醇激素受体活性等；预测靶点在“生物过程”中，主要富集于调节细胞增殖和凋亡、RNA 信号转录、信号传导、炎症反应等；在“分子功能”中，主要富集于蛋白结合、酶结合、蛋白酶活性及细胞因子活性等方面，其GO 条目富集图见图8。

2.6 KEGG 通路富集分析 通过R 语言软件中的Cluster-Profiler KEGG 对筛选出的基因进行KEGG 通路富集分析，建立靶点-通路网络图，197 个靶点可富集到160 条信号通路中（P＜0.05），前20 条主要通路见图7。再对其进行富集分析，排除与肿瘤、抗病毒等无关的通路，发现富集度最高的为PI3K-Akt 信号通路，同时还涉及到TNF、、IL-17信号通路等，具体见图9～10。

图8 GO 分析条目富集图

图9 KEGG 条目柱状图

图10 KEGG 通路富集图

2.7 通路图标注 根据KEGG 富集分析所得到的通路ID 信息，从通路数据库中获取具体通路图，将富集度最高的PI3K-Akt 信号通路进行富集分析，发现基因关联度最高的基因为AKT1，起到中枢调节作用，意义最大，具体见图11。

3 讨论

心力衰竭的发生与离子缺陷、炎症和重构、心肌肥厚等密切相关，新型生物标志物的发现有利于其早期诊断。中医药在心力衰竭诊断治疗过程中的优势和特色明显，积累了丰富的临床经验，中西医结合有利于患者得到全方位综合性治疗。升陷汤作为临床上常用的治疗心力衰竭的经典中医方剂，对其药理机制的研究显得尤为迫切。

图11 升陷汤调节PI3K-Akt 通路的具体因子

本研究采用网络药理学方法构建了升陷汤“成分-疾病-靶点”交互网络图，筛选出76 种潜在药物成分和197个共同作用蛋白靶点。其中，药物成分主要有黄芪总皂苷、柴胡皂苷、升麻苷、知母皂苷等，与心力衰竭关系密切，例如黄芪总皂苷干预阿奇霉素诱导的心力衰竭大鼠模型中可明显升高EF，降低FS、LVIDs、LVIDd 明显缩小，并且收缩时左室间隔厚度增加，左室重量指数减少，从而改善心力衰竭大鼠心功能，延缓左室重构［18］；黄芪多糖可能通过激活慢性心衰大鼠AMPK 相关通路来促进心肌摄取利用FFA，从而改善慢性心衰［19］；柴胡皂苷可使离体蛙心心肌收缩力先增强后减弱，其作用机制可能与激动心肌细胞上的β 受体进而激活L 型钙通道有关，从而改善心功能［20］；升麻苷在体外培养的乳鼠心脏微血管内皮细胞中金额明显抑制血管内皮细胞分泌炎性细胞因子，从而起到保护心脏微血管的作用［21］。

在升陷汤干预心力衰竭的核心基因靶点筛选和信号通路富集分析中发现，基因关联度最高的为Akt1，信号通路富集度最高的是PI3K／Akt。丝氨酸／苏氨酸激酶Akt 在哺乳动物中Akt 有3 种亚型，即Akt1、Akt2、Akt3［22］，其中Akt1 主要参与细胞凋亡的途径，来调节细胞的存活与否；Akt2、Akt3 分别多表达于胰岛组织、脑组织［23］，它是PI3K／Akt 信号通路的中心，为PI3K 信号转导通路中重要的下游靶点［24］。PI3K／Akt 信号通路是参与细胞增殖调控的重要通路之一，既有抗凋亡作用，又有促凋亡作用，以前者为主，它是调节细胞周期的重要通路，与其生长、增殖密切相关，在维持细胞生存中发挥重要作用［25］。

心功能障碍、恶化是多种心血管疾病的最终归宿，尤其是心力衰竭，可加速心室重构、心肌细胞凋亡、心肌纤维化等最终导致心脏结构、功能发生改变，最终导致心功能急剧恶化［26］。PI3K／Akt 是调节心脏功能的一条重要的信号转导通路，是心脏调制的压力阀，适度激活可抑制心肌细胞凋亡，抑制心室重构、调节能量代谢，但过度激活反而会导致心功能障碍［27-28］。Sun 等［29］发现，在心衰大鼠中激活PI3K／Akt 信号通路可减轻心功能障碍，抑制心脏纤维化，并且其心肌肥厚也得以控制。心肌纤维化在心力衰竭的病因学中起着重要的作用，有研究表明PI3K／AktmTOR 信号通路可调节心肌成纤维细胞的增殖和迁移，可能与心力衰竭的心肌纤维化和功能障碍相关［30］；Li 等［31］报道，在异丙肾上腺素诱导的心力衰竭大鼠模型中，PI3K／Akt 信号通路可激活对心脏组织炎症、氧化应激、凋亡的抑制作用；心脏的能量代谢在维持心脏功能方面发挥关键作用，新近研究发现，PI3K／Akt 信号通路可平衡心脏能量代谢，能促使葡萄糖、蛋白质、脂质等特定基因表达增加，进一步调节心肌细胞中葡萄糖、脂类的能量代谢途径，从而更好地发挥为心肌细胞供能的作用，有效延缓心脏功能障碍的速度［32-33］。

综上所述，本研究所发现的升陷汤相关通路及靶点可为该方今后的深入探讨奠定理论基础。但本研究仅从网络药理学角度推测了升陷汤主要活性成分及其可能作用机制，后期仍需进行实验验证，尤其是新发现的抗肿瘤、抗病毒、调节糖尿病相关通路。