PCR 结合斑点杂交技术检测禽多瘤病毒方法的建立及应用

张富友，于晓慧，蒋文明，孙淑红，赵 鹏，刘华雷，李 阳

（1.山东农业大学，山东泰安 271018；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266114）

鹦鹉幼雏病（budgerigar fledgling disease，BFD）是由禽类多瘤病毒（avian polyomavirus，APV），早期称为鹦鹉幼雏病病毒（budgerigar fledgling disease virus，BFDV）引起的多种鹦鹉幼雏死亡的急性病毒性传染病，主要感染出壳1～3 周的鹦鹉，表现为厌食、消瘦、皮下出血、腹泻和呼吸困难等症状，死亡率可高达80%，并可感染其他多种禽类[1-2]。日龄较小的虎皮鹦鹉（budgerigar，Melopsittacus undulatus）感染APV 时常被称为“法国蜕皮（French molt）病”[3]。该病1981 年首次报道于美国和加拿大[4-5]，随后迅速蔓延到日本、意大利、德国和匈牙利等国家[2，6]。1994 年我国湖北省云梦县和山东省青岛市首次报道发生BFD[7-11]。此后，该病在我国饲养鹦鹉较多的许多省市广泛传播，如湖北、山东、广东等，给我国伴侣鸟贸易和鹦鹉养殖业造成较大经济损失。

APV 属于多瘤病毒科（Polyom aviridae）多瘤病毒属（Polyom avirus），是一种无囊膜的双链DNA 病毒，病毒粒子直径为40～50 mm[4，12]，大小约为5 kb[13]。APV 基因组分为早期、晚期基因编码区及非编码区。早期编码区编码1 个大肿瘤抗原（大T 抗原）和1 个小肿瘤抗原（小t 抗原）；晚期编码区编码主要结构蛋白VP1 和3 个次要结构蛋白VP2、VP3 和VP4。VP1 蛋白是主要的保护性抗原，而3 个次要蛋白也存在于病毒衣壳中[13-14]。APV 非编码区可能含有复制起始位点和早期及晚期启动增强序列。

目前，该病主要根据临床表现和组织学观察作出初步诊断，而确诊需要进行电镜观察、病毒中和试验或PCR 检测。但现有的检测方法都存在一定的局限性及非特异性。为提高分子生物学方法检测APV 的敏感性和特异性，本研究通过用地高辛（digoxinum，DIG）标记核酸探针，建立了一种快速、灵敏、特异的APV 检测方法，并对鉴定阳性的APV 进行了完整的基因组测序以及遗传特性和进化程度分析。

1 材料与方法

1.1 病毒和病料

APV 参考株：由山东农业大学家禽肿瘤病实验室鉴定、保存。病料：收集山东省某鹦鹉养殖场病死虎皮鹦鹉的肝脏、肾脏、心脏等病料组织，经研磨后采用组织基因组DNA 提取试剂盒（OMEGA），按说明书提取细胞总DNA，-20 ℃保存备用。

1.2 核酸探针制备及灵敏度和特异性检验

利用本实验室保存的APV 参考株VP1基因质粒，根据已经发表的APV 全基因组序列，通过序列比对设计引物（AP-F1：5'-CAGAACATATCGAAATGG-3'；AP-R1：5'-TGCAGATATCAAGACTGCC-3'），由上海生物工程有限公司合成探针。按照罗氏公司PCR DIG Probe Synthesis Kit 说明书，合成针对APV 的DIG标记核酸检测探针。将定量好的阳性参考株核酸梯度稀释至103、102、101、100、10-1pg/µL，按照文献[14]方法进行核酸斑点杂交，对制备的探针进行灵敏度检测，同时与普通PCR 进行敏感性比较。

将本实验室分离鉴定和制备保存的禽网状内皮组增生症病毒（REV）cDNA、鸡马立克氏病病毒（MDV）DNA、鸡传染性贫血病毒（CIAV）DNA、禽白血病病毒（ALV）cDNA、鸡呼肠孤病毒（ARV）cDNA、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）cDNA、鹦鹉喙羽病病毒（PBDFV）DNA，使用所制备探针，按照文献[14]方法进行核酸斑点杂交，对制备探针进行特异性检测。

1.3 鹦鹉病料APV 核酸检测

参照已发表的APV 全基因组序列[15]，通过序列比对，设计合成用于检测APV 的引物（AP-F：5'-GAACATATCGAAATG-3'；AP-R：5'-CAGATATCAAGACTG-3'）。取2.0 μL 待检病料所提取DNA 模板，加入23.0 μL 的PCR 混合液：2.5 μL 10×PCR buffer，2.5 μL dNTP（2.5 mmol/L），引物AP-F、AP-R（10 μmol/L）各1.0 μL，0.7 μLTaqDNA Polymerase（3.5 U/μL），加双蒸水至23.0 μL。PCR 反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共31 个循环；72 ℃延伸10 min。取2.0 μL 上述PCR 产物点样于尼龙膜上，按照文献[15]方法，使用制备探针进行核酸斑点杂交检测。

1.4 阳性样品APV 全基因组克隆测序和序列分析

取斑点杂交检测为阳性的病料组织基因组DNA，参考已发表的APV 全基因组序列[15]，设计合成2 对引物（表1），分段扩增2 段相互重叠的片段，用于阳性样品APV 的全基因组克隆测序。按TaKaRa ExTaq酶试剂盒（TaKaRa，Code No.RR001A）使用说明，用这2 对引物分别进行PCR扩增。PCR 扩增产物经1.0%琼脂糖电泳鉴定并将目的条带切下，然后使用E.Z.N.A Gel Extraction Kit（OMEGA，USA）回收纯化DNA；将纯化的DNA 连接到PMD-18T Vector（TaKaRa，Japan）后，转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α；挑取单个菌落以Plasmid Mini Kit（OMEGA，USA）提取质粒进行酶切鉴定，阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序。

表1 用于扩增APV 全基因组序列的引物

1.5 序列比对和遗传进化分析

使用DNAstar 软件，将分别测序的两段核苷酸序列进行拼接以获得病毒的全基因组序列，将其与GenBank中已发表的代表性APV参考序列（表2）进行全基因组序列比对，分析分离毒株与不同参考毒株间的核苷酸同源性，并绘制分子遗传进化树。

2 结果与分析

2.1 VP1 基因PCR 扩增和探针标记

以APV-VP1 质粒为模板，用AP-F1 和AP-R1引物扩增VP1基因片段，结果出现与预期相符的731 bp 目的条带。标记的探针从电泳图谱上看，明显滞后于普通dNTP 扩增产物条带（因带有DIG标记的dNTP 分子质量较大，导致电泳速度较低），说明标记成功（图1）。

表2 用于绘制APV 毒株分子遗传进化树的参考株

图1 APV 探针标记结果

2.2 核酸探针灵敏性检测

将APV 阳性对照核酸倍比稀释至103、102、101、100、10-1pg/µL，分别取2 μL 点样在尼龙膜上，使用制备的APV 核酸探针进行斑点杂交。由图2可见，APV 特异性核酸片段为2×103～2×100pg的量时，核酸显色，呈阳性反应；APV 特异性核酸片段为2×10-1pg 的量时及阴性对照，核酸均不显色，呈阴性反应。敏感性统计结果见表3。由图3 可见，当APV 特异性核酸片段在2×105～2×101pg的量时，PCR 电泳结果呈阳性反应；而APV 特异性核酸片段为2 pg 量时及阴性对照核酸，PCR 电泳结果呈阴性反应。结果表明，该探针可检测到2 pg 量的APV 特异性核酸片段，且本检测方法较普通的PCR 检测方法具有更好的敏感性。

图2 APV 核酸探针灵敏性检测结果

表3 APV-VP1 探针的灵敏性检测信号强度统计

图3 PCR 灵敏性检测结果

2.3 核酸探针特异性检测

将已知背景的REV-DNA、MDV-DNA、CIAV-DNA、ALV-DNA、ARV-DNA、IBV-DNA、PBFDV-DNA 以及APV-VP1 阴性核酸、阳性核酸分别点样在尼龙膜上，使用制备的APV 核酸探针进行斑点杂交。由图4 可见，仅有APV-VP1 阳性核酸显色，呈现阳性反应，而阴性核酸和REV、MDV、CIAV、ALV、ARV、IBV 以及PBFDV 的DNA 均不显色，呈阴性反应，表明合成的核酸探针特异性强，仅识别APV 阳性核酸而不识别其他非APV 核酸成分。

图4 APV 探针的特异性检测结果

2.4 核酸探针病料检测

对收集的8 份病死鹦鹉肝脏、肾脏、心脏等病料组织提取的DNA，用本研究建立的方法进行检测，检出2 份阳性（图5），均来自肝脏样品。

图5 临床病料样品PCR 产物斑点杂交检测结果

2.5 阳性样品APV 全基因组序列测定与进化分析

利用DNAstar 软件，对2 个阳性样品的PCR片段进行了APV 全基因组核苷酸序列测定，并分别命名为APV-SD03 株和APV-SD05 株，全长分别为5 952 bp 和5 956 bp。将序列提交到GenBank，获得的序列号分别是MH712455 和MH712456。

BLAST 和DNAstar 软件分析结果显示，本研究所得到的APV-SD03 株和APV-SD05 株序列与GenBank 中已发表的25 株APV 分离株全基因组序列同源性为99.3%～99.7%。序列比对结果显示，APV-SD03 株共有17 个核苷酸位点的改变，APVSD05 株共有18 个核苷酸位点的改变。统计不同基因组区域碱基变异情况可见，2 株毒株均在大T 抗原区发生了最高的变异率，且APV-SD05 株在T/t抗原区，4 724 位置处有1 个核苷酸替换，并引起了氨基酸V →A 的改变。

对GenBank 收录的25 个APV 全序列以及APV-SD03 株和APV-SD05 株序列，使用MEGA 5.0 软件绘制以全基因组核苷酸序列为基础的APV毒株分子遗传进化树（图6）。在该进化树中，可以将其划分为Ⅰ—Ⅳ家系：家系Ⅰ分离株的地理范围包括美洲、欧洲以及亚洲，其中5 株从鸡分离到，而其他的则从鸟分离到；家系Ⅱ主要为亚洲的日本分离株和中国分离株，都从鸟分离到；家系Ⅲ为单独的大分枝；家系Ⅳ包含了澳洲的新西兰分离株、美国分离株以及2012 年的中国高密分离株，也都从鸟分离到。从进化树推测，分离毒株在物种的特异性上存在一点关系，而在地理分布上没有明显关联。在该研究中，APV-SD03 株和APV-SD05 株位于家系Ⅱ的同一支上，表明两分离株基因组之间在流行病学上相关联；该家系中其他分离株的宿主都是鸟类，且只有FJ385773、APV-SD03 株、APVSD05 株为中国分离株，其他4 株均为日本分离株，可以看出其与日本分离株之间有较近的亲缘关系。2012 年中国高密分离的WF-GM01 株位于家系Ⅳ中，而APV-SD03 株、APV-SD05 株与其基因组序列进行比对后发现有部分氨基酸的突变，从而导致了上述几株毒株不在一个分支上。

图6 APV 毒株分子遗传进化树

3 讨论

APV 是引起鹦鹉类（种、群）发生高死亡率的急性病毒性传染病病原。20 世纪80 年代初，此病首先在美国和加拿大被报道，随后相继在日本、意大利、匈牙利等国家出现。我国首次于1994 年报道该病流行[4-10]。2002—2005 年，有研究[16]证实，我国台湾鹦鹉中存在APV。2008 年后，国内多家宠物鹦鹉养殖场连续暴发由APV 引起的BFD，给我国养鸟业带来重大损失[17]。还有研究[19]显示，不同基因型的APV 在我国共同流行[18]。至今，BFD 仍在我国某些地区散发流行。目前，对于本病的防治尚无较好的控制手段。

目前，APV 核酸检测主要基于建立的PCR 法。该方法虽灵敏度高，但有时会出现非特异性反应，一般需要将PCR 产物回收后连接到相应载体上，经过测序才可作出最终判断，这就大大增加了检测的时间和成本。因此，亟需建立一种更加快速、准确、易操作的检测方法。DIG 标记DNA 探针杂交检测法具有特异性强、灵敏性高、操作方便、检测时间短、性质稳定等优点，是目前常用的分子生物学诊断技术。本研究建立了一种针对APV 的特异性核酸探针斑点杂交检测方法，并通过相应试验验证了其可以检测到2 pg 量的APV 核酸，且只对APV 核酸呈现阳性反应，而对REV、MDV、CIAV、ALV、ARV、IBV 以及PBFDV 的DNA 均呈现阴性反应，证明该APV 的核酸探针斑点杂交检测方法具有较高的灵敏度和较强的特异性。

本研究利用制备探针对发病鹦鹉病料进行APV 检测，共检出2 份阳性样品，并对其进行了全基因组序列测定及遗传进化分析，结果发现2 株毒株与国内外已发表的25 株APV 全基因组核苷酸同源性高度一致，为99.3%～99.7%。该序列分析结果也与之前Rott 等[20]、Phalen 等[21]和Johne等[22]研究报道的结果一致。APV 序列分子结构方面，通过序列比对，分析其碱基变异情况，可知T抗原变异率最高，推测这可能与APV 的宿主范围广泛有关。APV 全基因组序列绘制的遗传进化树显示，27 株APV 共划分为Ⅰ—Ⅳ家系。本研究的APV-SD03 株和APV-SD05 株都位于Ⅱ家系的同一分枝上，表明两分离株在流行病学上相关联。从整体进化树可推测，分离毒株在种属特异性上存在一点关系，而在地理位置间没有显著关系。

我国是一个候鸟迁移和家禽养殖大国，因此有效控制鸟类的APV 感染非常重要。本研究建立了一种灵敏度更高、特异性更强的PCR 产物斑点杂交检测方法，并对鉴定阳性的毒株进行全基因组序列测定及遗传进化分析，从而加深了对APV 进化途径的了解，对于预防和控制APV 感染具有重要意义。