畜禽产品中四环素类药物残留色谱质谱检测技术及前处理方法研究进展

秦立得，孙晓亮，周微微，孙荣钊，宋翠平

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊 261061）

四环素类药物（Tetracyclines，TCs）是一类天然或半合成药物，对多种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、衣原体、支原体等致病微生物具有良好的杀灭和抑制作用。四环素类药物包括20 余种药，常见的有四环素（Tetracycline，TE）、强力霉素（Doxycycline DC）、金霉素（Chlortetracycline，CTC）和土霉素（Oxytetracycline，OTC）。在畜牧业中，四环素类药物价格低、抗菌谱宽，被广泛用于动物疾病预防和治疗中。也正因为如此，四环素类药物的消耗量占药物总消耗量的比例较高，其中欧盟占比约为46%，美国占比约为15.8%[1]。不合理使用或滥用药物，导致动物源性食品及环境中四环素类药物残留超标的情况时有出现，威胁公共卫生安全。消费者长期食用四环素类药物残留超标的食品，可出现牙齿变黄、过敏反应、肝脏损伤、肠道紊乱等不良反应，还可导致体内细菌耐药性增强[2]。环境中药物残留超标可导致微生物耐药性增强，出现新的耐药菌株，并可能成为在人或动物中传播的新致病菌，给疾病的治疗和预防增加难度[3]。因此，对动物源性食品进行四环素类药物及其代谢物检测，对保障公共卫生安全具有重要意义。

仪器分析法、免疫学法、微生物法、生物传感器等多种方法在四环素类药物检测中得到应用，其中应用最广泛的是仪器分析法和免疫学法。免疫学法多用于现场快速检测及样品初筛，具有操作简单、检测速度快、成本低等优点。与免疫学法相比，仪器分析法具有结果准确可靠、重现性好、稳定性高等优点，并可实现同时对多类药物的快速定量检测，被广泛用于药物残留检测和确证，但同时也存在仪器昂贵、运行及维护成本高、试剂耗材价格高、检测时间长等缺点。高效液相色谱（HPLC）法及液相色谱串联质谱（LC-MS）法是最常用的仪器分析法，其中高效液相色谱紫外检测器（HPLC-UV）法是国际分析化学家协会（AOAC）推荐使用的牛奶中四环素类药物检测方法，也是我国国标方法之一。前处理是样品检测的关键环节，如何快速完成样品的前处理，并实现对多类药物的同步提取，是目前研究的热点。本文汇总了目前部分国家和国际组织四环素类药物最大残留限量标准，动物源性食品中四环素类药物残留色谱及质谱分析法研究进展，特别是对样品前处理方法研究进展进行综述。

1 限量标准

为保证食品安全，我国及国际食品法典委员会、欧盟、加拿大等国家与国际组织，对动物源性食品中四环素类药物最大残留限量（MRLs）做了严格规定（表1）[4]。我国各级农业农村部门及市场监管部门持续对从农场到餐桌的全产业链，开展药物残留监测工作，监测结果显示动物源性食品质量持续向好。

表1 部分国家和国际组织四环素类药物最大残留限量标准

2 研究进展

将仪器检测方法和样品前处理方法有机融合可实现目标残留物的高效检测。HPLC 及LC-MS法是检测四环素类药物的主要方法，也是目前研究与应用的热点，约占近期文献报道相关分析方法总数的70%[5]，并实现了从牛奶、猪肉、鸡蛋等多种基质中检测四环素类药物。通常来说，液相色谱仪包含与液相色谱系统串联的紫外检测器（UV）、二极管阵列检测器（DAD）、荧光检测器（FL）等检测器，液相色谱串联质谱仪常用的质谱检测器包括四级杆质谱（MS）、三重四级杆质谱（MS/MS）、飞行时间质谱（TOF）等。四环素类药物最大紫外吸收波长介于270～360 nm，是液相色谱串联相关检测器选用的检测波长。LC-MS 法操作方便，可同时检测多类药物，能对检测物实现更加准确的定性，因而在多残留检测分析中得到广泛应用。此外，毛细管电泳（CE）法、分光光度法等仪器分析法，在动物源性食品的药物残留检测中也得到研究与应用，但近年来研究较少[6-7]。

在使用仪器检测四环素类药物残留时，需要经过前处理，将样品转变为可上机检测的试样，因而样品前处理是研究的重点和难点。样品前处理是残留检测的关键步骤，包括制备样品、提取待测物、净化提取液、富集待测物等，存在耗时长、步骤繁琐、方法建立困难等难点。目前大部分的相关研究集中于改进提取方法、优化净化方法和简化步骤等方面。

2.1 提取方法

四环素类药物提取较难，在不同基质中回收率一般，这与其理化性质有关。四环素类药物极性较强，pKa 约为3.2～9.8，易与蛋白结合[8]；易形成差向异构体，酸性条件下相对稳定，但在pH ＜2 时易降解；易与金属离子形成螯合物[9]。常用的四环素类药物提取液包括，水、乙腈、甲醇、盐酸、乙二胺四乙酸（EDTA）溶液、EDTA-McIlvaine 缓冲液、三氯乙酸溶液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液等，但最常用的为EDTA-McIlvaine 缓冲液（pH4.0），且大多数提取体系含EDTA 以螯合金属离子，避免金属离子与四环素类药物形成螯合物。

经典的提取方法包括液液萃取法、固相萃取法、分散萃取法等。随着自动化技术和新材料科技的发展，传统方法不断得到改进，出现了固相微萃取法、液液微萃取法、分散固相微萃取法等微萃取方法。与经典的提取方法相比，微萃取方法使前处理所需的样品和试剂减少，而提取液和提取方式变化不显著。2016 年Mookantsa 等[10]建立了检测牛肉样品中四环素类药物的分散液液微萃取方法。提取方法为：在1 g 牛肉中加入6 mL 提取液（水:乙腈=8:1，V/V）、300 mg 硫酸镁、150 mg 氯化钠和50 mg 柠檬酸钠涡旋均匀，离心后收集上清液，进行进一步净化。结果显示，该方法的检测限为2.2～3.6 µg/kg，定量限为7.4～11.5 µg/kg，回收率为80%～105%。

QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged and safe）是2003 年首次报道的样品前处理方法[11]，可用于大量样品处理，目前在四环素类药物的残留检测中得到应用。该方法多用甲酸、乙腈等有机试剂以及氯化钠、硫酸镁等盐提取样品；分离的上清液经N-丙基乙二胺（PSA）、NH2等吸附剂吸附杂质，再浓缩后溶解或过滤即可进行检测。2016 年张科明等[12]建立了检测猪肉中四环素类、磺胺类、喹诺酮类等7 类 35 种药物的QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法。提取方法：2 g 样品与5 mL EDTA-McIlvaine 缓冲液混匀，超声处理后离心；沉淀中加入20 mL 2.5%乙酸乙腈溶液，涡旋离心，合并提取液并加入2 g 氯化钠、2 g 硫酸钠，分离上清液净化后检测。结果显示，该方法的检测限为0.01～1.01 µg/kg，定量限为0.04～3.37 µg/kg，回收率为71.8%～113.5%。2018年方从容等[13]建立了检测鸡蛋中四环素类、大环内酯类、性激素类等125 种药物的QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法。提取方法：在2 g 样品中，加入1 mL 水和0.4 mL 0.1 mol/L 的 EDTA溶液，混匀后加入7 mL 乙腈，涡旋混匀离心；取上清液定容至10 mL，冷冻2 h 后离心，取上清液加入吸附剂处理后分析。结果显示，该方法的定量限为10～20 µg/kg，回收率为60.4%～119.3%。

在新的提取方法研究方面，2014 年Kaufmann等[14]建立了四环素类、喹诺酮类、磺胺类和β-内酰胺类等多类药物的盐析支撑液-液萃取法。提取方法为：将5 mL 牛奶、5 mL 提取液（4.3 g 草酸和3.7 g EDTA 溶于500 mL 水，pH3.0）和10 mL 乙腈混合震荡，离心取上清液，加入1 g 硫酸铵，搅拌至有机相和水相分离，取有机相净化。结果显示，该方法对四环素类药物的检测限为0.4～2.0 μg/L，回收率为49%～54%，且该方法比QuEChERS 法更适合提取极性较高的药物。2016 年Moreno-gonzález 等[15]建立了检测婴幼儿食品中四环素类药物的盐析支撑液-液萃取法。该方法将1 g 和1.5 mL EDTAMcIlvaine 缓冲液混合均质后，先后加入3.2 mL乙腈、1.25 g 硫酸铵，震荡后离心，取上层有机相氮吹至近干，复溶后检测。结果显示，该方法的检测限为0.48 µg/kg，回收率为 89.2%～96.8%。2017年Gao 等[16]优化了基于萘甲酸的离子液体，作为“非有机溶剂”提取液，建立了用于测定牛奶和鸡蛋中四环素类药物的微萃取法。提取方法为：将5 mL 样品与80～160 μL[C6MIM][PF6]，75～150 μL[C2MIM][BF4]和15～90 μL [C4MIM][NPA]混合超声4 min 后，加入0.11～0.33 g 的NH4PF6超声处理4 min，离心取下层离子液稀释后分析。结果显示，该方法的检测限为0.08～0.46 µg/kg，定量限为0.25～3.69 µg/kg，回收率为94.1%～102.1%。

此外多篇文献报道了各种提取试剂的优化及最佳提取方法。2012 年Capriotti 等[17]建立了检测鸡蛋中四环素类、青霉素类、氟喹诺酮类、磺胺类等药的提取方法。该方法比较了27 种提取液配方，经验证最佳提取方法为，1 g 样品中加入4 mL提取液（甲醇:水:甲酸=80:20:1，V/V/V）、0.5 g甲酸钠和 2.0 g 无水硫酸钠。2017 年Wang 等[18]建立了检测鸡蛋中四环素类、磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类和β-内酰胺类等9 类64 种药物的检测方法。该方法比较了不同浓度的EDTA 和甲酸对提取效果的影响。最终优化方案为：在2 g 样品中加入7.5 mL 提取液（乙腈:水=90:10，V/V）和0.5 mL 0.1 mol/L 的EDTA 溶液，涡旋后超声处理15 min。

2.2 净化方法

使用固相萃取（SPE）柱净化提取液是最常用的净化方法。一般步骤为：将提取液或处理后的提取液转移至活化的固相萃取柱，将目标药物保留在填料上，对SPE 柱进行淋洗去除杂质后，使用洗脱液洗脱药物，收集洗脱液氮吹至近干，然后用复溶液溶解过滤检测。在使用SPE 柱提取净化四环素类药物时，最常用的SPE 柱为HLB 柱。但该柱对多种药物的保留能力有限，并存在待测物难以洗脱而影响检测的问题[17-18]。正己烷净化提取液、提取液冷冻后离心等物理净化方法也得到使用，但在多残留检测时正己烷的不合理使用可能影响部分药物回收，提取液冷冻后离心的方法也存在耗时较长的缺点[13，19]。

在使用QuEChERS 法净化样品时，需要注意避免使用过多的吸附剂，同时要根据待测物性质选择合适的吸附剂，以免造成待测物损失。在QuEChERS 法吸附剂的使用方面，2015 年Wang等[20]优化并确定了检测牛奶中四环素类、β-内酰胺类、大环内酯类、喹诺酮类和磺胺类药物的吸附剂及用量。提取方法：取10 g 样品先后经15 mL的1%乙酸乙腈和10 mL 的1%氨水乙腈提取，分离合并上清液，取5 mL 液体用不同组合的净化剂进行净化。结果显示，四环素类药物最佳净化剂为96 mg C18、57.8 mg PSA 和1.14 g 乙酸钠。

随着科技的发展，磁性材料、分子印迹物等新材料成为研究热点，并用做SPE 柱填料、QuEChERS法吸附剂、微萃取方法吸附剂等净化剂。

在磁性材料开发与应用方面，2015 年Castillo-García 等[21]使用铕和铽包被的磁性纳米材料作为吸附剂建立了检测动物肌肉中四环素类和喹诺酮类药物的分散固相微萃取法。该方法的检测限为1.0～3.8 µg/kg，回收率为61.5%～102.6%。2017年Yu 等[22]制备了乳酸-纳米磁铁复合物，并使用该复合物建立了检测牛奶中四环素类药物的方法。该方法的检测限为3.2～7.1 µg/kg，定量限为10.7～23.7 µg/kg，回收率为95.2%～106.2%。2018年Nour 等[23]制备了β-环糊精官能化的磁性石墨烯材料，并使用该材料建立了检测牛奶中四环素类药物的方法。该方法的检测限为1.8～2.9 µg/L，定量限为6.1～9.7 µg/L，回收率为70.6%～121.5%。2018 年Wang 等[24]使用新型磁性石墨烯管作为吸附剂，建立了检测牛奶中四环素类药物残留的方法。该方法的检测限为1.29～2.31 µg/L，定量限为4.26～7.62 µg/L，回收率为91.6%～109.7%。

在分子印迹物合成与应用方面，2017 年Wang等[25]以四环素为模板分子合成了分子印迹聚合物，并使用该复合物提取奶粉中的四环素类药物。该方法检测限为0.217～0.318 µg/kg，定量限为0.723～1.060 µg/kg，回收率为84.7%～93.9%。2017 年Wang 等[26]使用喹诺酮类药物的哌啶酸分子、磺胺类药物的磺胺苯甲酰胺分子和四环素类药物中的金霉素，合成了混合模板分子印迹聚合物（MMIP），并建立了能同时检测猪肉中这三类药物的方法。该方法检测限为0.5～3.0 µg/kg，定量限为1.5～6.0 µg/kg，回收率为74.5%～102.7%。

目前已有多种改良的商品化SPE 柱和QuEChERS 试剂盒在售，如沃特世公司的PRiME HLB 和安捷伦公司的EMR-Lipid 等SPE 柱以及安捷伦公司的d-SPE EMR-Lipid 等QuEChERS 试剂。这些产品得到了广泛研究与应用。2016 年Tian 等[27]使用PRiME HLB 柱建立了检测牛奶及奶粉中四环素类、磺胺类、大环内酯类等61 种药物的多残留检测方法。提取方法为：1 g 样品与4 mL 乙腈混匀涡动，分离上清液过PRiME HLB 柱，收集流穿的液体浓缩后检测。结果显示，该方法的检测限为0.003～1.57 µg/L，定量限为0.01～5.18 µg/L，回收率为61.5%～118.6%。

在其他新材料运用方面，2018 年Edvaldo 等[28]使用二氧化硅-石墨烯作为吸附剂，建立了检测牛奶中四环素类药物残留的方法。该方法的检测限为0.03～0.21 µg/L，定量限为0.05～0.9 µg/L，回收率为87.9%～118.4%。2019 年Zhao 等[29]合成了新型HLB 柱填料CTPCC-TP，并制备了HLB（含60 mg 填料）柱，建立了检测牛肉、鸡蛋和鸡肝中四环素类药物残留的方法。该方法的检测限为8.0～16.8 µg/kg，定量限为22.6～55.9 µg/kg，回收率为81.3%～98.7%。

2.3 简化步骤

样品前处理分为目标化合物提取、提取液净化等多个步骤，导致样品前处理过程复杂、耗时较长，并且可能影响目标化合物的回收。将提取与净化等前处理步骤融合，将样品前处理步骤和上机检测步骤融合（如在线净化法），或实现样品前处理及检测的自动化，可有效减少试剂用量，缩短样品前处理时间，降低检测成本。

在简化前处理步骤方面，2015 年Jiao 等[30]使用选择性加压萃取法（selective pressurized liquid extraction，SPLE）建立了检测猪肉、鸡肉等样品的四环素类药物检测方法。该方法将3.0 g 样品与3.0 g 异烟酸铜粉末混合后处理，提取液浓缩后检测。结果显示，该方法检测限为0.1～6.3 µg/kg，定量限为0.33～20.7 µg/kg，回收率为75%～110%。

在自动化检测方面，2019 年Khaled 等[31]建立了能同时检测肉类中四环素类、大环内酯类、磺胺类等77 种药物的全自动固相微萃取法，可实现样品的自动化提取和净化。结果显示，该方法的平均回收率为80%～120%，对四环素类药物的定量限为10 µg/kg，回收率为63%。

在线净化法研究方面，2016 年de Faria 等[32]建立了检测牛奶中四环素类药物的检测方法。该方法使用盐酸沉降蛋白后分离上清液，注入柱交换系统，上清液流经含限制性碳纳米管的萃取柱，借助六通阀实现转换管路，并使用梯度流动相净化萃取柱后洗脱检测。结果显示，该方法检测限为9.22～13.20 µg/L，定量限为25.01～44.00 µg/L。2016 年Zhu 等[33]建立了能同时检测牛奶中大环内酯类、喹诺酮类、四环素类等88 种药物的在线净化LC-MS 法。将1 g 样品与0.1 g EDTA 和1 mL乙腈混匀超声萃取5 min，分离上清液过滤，随后用于在线SPE 净化和分析。结果显示，该方法的检测限为0.2～2.0 µg/L，定量限为0.5～10.0 µg/L，回收率为63.1%～117.4%。

3 展望

在动物源性食品四环素类药物残留检测方面，色谱法及质谱法可准确实现动物源性食品中药物残留定量检测，对保障公共卫生安全和环境安全具有重要意义。目前，HPLC 及LC-MS 法是研究与应用的热点，而如何快速完成样品前处理是其中的关键点与难点。随着科技的发展，多种新型材料运用于样品前处理中，既减少了试剂用量，也提升了净化效果，同时缩短了前处理时间，并实现了百余种药物的提取和净化。此外，四环素类药物快速检测方法可实现该类药物的现场快速定性及定量检测，增加了检测的实效性和灵活性，也是研究与应用的热点[34]。相信将来，仪器分析方法及快速检测方法会得到持续改进，新的方法会不断出现，食品和环境安全将会得到更有效的保障。